宁德市图书馆 17.5.2 实验方法
内容
17.5.2.1 植物提取物制备
采用有机溶剂浸提法。植物材料洗净、风干后再烘干至发脆，将其粉碎。用5倍量的甲醇浸泡植物干粉，期间搅拌2～3次，24h后抽滤。浸提2次，将2次滤液合并后用旋转蒸发仪减压浓缩，得膏状粗提物，置于4℃冰箱中保存，备用。
17.5.2.2 植物活性成分分离与鉴定
初步分离：植物材料的甲醇粗提物用液-液萃取法分离。先用二定量的蒸馋水溶解一定质量粗提物，置于分液漏斗中，再加入等量的石油酷，充分摇匀后置于铁架台上静置一段时间，待分层稳定后，用烧杯从分液漏斗下端接水层，石油醚层则从漏斗上部倒出。相同方法萃取三次，合并三次石油醚层，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状并称量。再用同样的方法依次从水层中萃取得到乙酸乙酯层、正丁醇层萃取物。
硅胶层析：植物甲醇粗提物或萃取物先用100～200目硅胶进行柱层析分离，通过薄层层析检测合并相同或相似的馏分，对各组分进行活性测定后确定活性馏分。经过多次硅胶柱层析分离得到以活性化合物为主要物质的馏分，并用中性氧化铝进行层析脱色，再用高效液相色谱仪进行检测、纯化，最终获得纯化合物。
化学结构鉴定：分离得到的化合物，测定并解析其核磁共振谱（NMR）、质谱（MS），再参考相关文献进行结构鉴定。
NMR:以氘代甲醇、氘代DMSO为溶剂，测定1H-NMR，13C-NMR和DEPT135°谱。
MS:采用电子轰击ESI-MS质谱法。
17.5.2.3 生物活性测定
（1）动物病原菌的抑制活性测定：通过带毒平板法和滤纸片扩散法测定动物病原菌的抑制活性。
（2）动物病原菌的最低抑制浓度（MIC）测定：参照对动物病原菌的抑制活性测定方法，将样品配成一系列浓度，制成一系列浓度的带毒培养平板，37℃条件下培养72h后，观察结果，以不长菌的最低浓度为药液对动物病原菌的MIC。
（3）植物病原真菌菌丝生长的抑制活性测定：参照陈年春[12]采用菌丝生长速率法测定。把样品配成一定浓度的药液（溶剂为丙酮和水，体积比1:1）。在无菌洁净工作台中，把1mL药液（对照组用空白溶剂代替）与9mL热溶马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）混合均匀，倒入直径为9cm的培养皿中制成厚薄均匀的带药培养基。在已活化的供试菌边缘，用直径为0.4cm的无菌打孔器切取菌饼，并接到带药培养基上（菌丝面朝下），每个培养皿接3个菌饼（品字形分布），每个处理设3个重复。置于（27±1）℃光照培养箱中培养72h后，用十字交叉法测量菌落直径，根据下列公式计算抑制率。
抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）÷对照菌落直径×100%
菌落直径（cm）=测量直径-0.4
测定有效中浓度（EC50）时，配制5个系列浓度的药液，测定各个浓度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回归方程、有效中浓度。
采用有机溶剂浸提法。植物材料洗净、风干后再烘干至发脆，将其粉碎。用5倍量的甲醇浸泡植物干粉，期间搅拌2～3次，24h后抽滤。浸提2次，将2次滤液合并后用旋转蒸发仪减压浓缩，得膏状粗提物，置于4℃冰箱中保存，备用。
17.5.2.2 植物活性成分分离与鉴定
初步分离：植物材料的甲醇粗提物用液-液萃取法分离。先用二定量的蒸馋水溶解一定质量粗提物，置于分液漏斗中，再加入等量的石油酷，充分摇匀后置于铁架台上静置一段时间，待分层稳定后，用烧杯从分液漏斗下端接水层，石油醚层则从漏斗上部倒出。相同方法萃取三次，合并三次石油醚层，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状并称量。再用同样的方法依次从水层中萃取得到乙酸乙酯层、正丁醇层萃取物。
硅胶层析：植物甲醇粗提物或萃取物先用100～200目硅胶进行柱层析分离，通过薄层层析检测合并相同或相似的馏分，对各组分进行活性测定后确定活性馏分。经过多次硅胶柱层析分离得到以活性化合物为主要物质的馏分，并用中性氧化铝进行层析脱色，再用高效液相色谱仪进行检测、纯化，最终获得纯化合物。
化学结构鉴定：分离得到的化合物，测定并解析其核磁共振谱（NMR）、质谱（MS），再参考相关文献进行结构鉴定。
NMR:以氘代甲醇、氘代DMSO为溶剂，测定1H-NMR，13C-NMR和DEPT135°谱。
MS:采用电子轰击ESI-MS质谱法。
17.5.2.3 生物活性测定
（1）动物病原菌的抑制活性测定：通过带毒平板法和滤纸片扩散法测定动物病原菌的抑制活性。
（2）动物病原菌的最低抑制浓度（MIC）测定：参照对动物病原菌的抑制活性测定方法，将样品配成一系列浓度，制成一系列浓度的带毒培养平板，37℃条件下培养72h后，观察结果，以不长菌的最低浓度为药液对动物病原菌的MIC。
（3）植物病原真菌菌丝生长的抑制活性测定：参照陈年春[12]采用菌丝生长速率法测定。把样品配成一定浓度的药液（溶剂为丙酮和水，体积比1:1）。在无菌洁净工作台中，把1mL药液（对照组用空白溶剂代替）与9mL热溶马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）混合均匀，倒入直径为9cm的培养皿中制成厚薄均匀的带药培养基。在已活化的供试菌边缘，用直径为0.4cm的无菌打孔器切取菌饼，并接到带药培养基上（菌丝面朝下），每个培养皿接3个菌饼（品字形分布），每个处理设3个重复。置于（27±1）℃光照培养箱中培养72h后，用十字交叉法测量菌落直径，根据下列公式计算抑制率。
抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）÷对照菌落直径×100%
菌落直径（cm）=测量直径-0.4
测定有效中浓度（EC50）时，配制5个系列浓度的药液，测定各个浓度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回归方程、有效中浓度。
