宁德市图书馆 内容
根据相关文献，简单阐述垂穗石松抗菌活性及其活性物质研究的实例[11]。
17.5.1 实验材料
植物材料：垂穗石松。
层析试剂：柱层析硅胶（100～200目和200～300目），薄层层析硅胶GF254（青岛海洋化工厂生产）。层析用100～200目中性氧化铝（国药集团化学试剂有限公司生产）。
分析纯：甲醇、丙酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等。
核磁共振所用溶剂：氘代甲醇（CD3OD），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）。
标准对照药剂：125g/L氯霉素注射液（上海现代哈森药业有限公司生产）。
其他常用试剂：氢氧化钠、盐酸、蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白腺、琼脂粉、蒸馏水等。
17.5.2 实验方法
17.5.2.1 植物提取物制备
采用有机溶剂浸提法。植物材料洗净、风干后再烘干至发脆，将其粉碎。用5倍量的甲醇浸泡植物干粉，期间搅拌2～3次，24h后抽滤。浸提2次，将2次滤液合并后用旋转蒸发仪减压浓缩，得膏状粗提物，置于4℃冰箱中保存，备用。
17.5.2.2 植物活性成分分离与鉴定
初步分离：植物材料的甲醇粗提物用液-液萃取法分离。先用二定量的蒸馋水溶解一定质量粗提物，置于分液漏斗中，再加入等量的石油酷，充分摇匀后置于铁架台上静置一段时间，待分层稳定后，用烧杯从分液漏斗下端接水层，石油醚层则从漏斗上部倒出。相同方法萃取三次，合并三次石油醚层，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状并称量。再用同样的方法依次从水层中萃取得到乙酸乙酯层、正丁醇层萃取物。
硅胶层析：植物甲醇粗提物或萃取物先用100～200目硅胶进行柱层析分离，通过薄层层析检测合并相同或相似的馏分，对各组分进行活性测定后确定活性馏分。经过多次硅胶柱层析分离得到以活性化合物为主要物质的馏分，并用中性氧化铝进行层析脱色，再用高效液相色谱仪进行检测、纯化，最终获得纯化合物。
化学结构鉴定：分离得到的化合物，测定并解析其核磁共振谱（NMR）、质谱（MS），再参考相关文献进行结构鉴定。
NMR:以氘代甲醇、氘代DMSO为溶剂，测定1H-NMR，13C-NMR和DEPT135°谱。
MS:采用电子轰击ESI-MS质谱法。
17.5.2.3 生物活性测定
（1）动物病原菌的抑制活性测定：通过带毒平板法和滤纸片扩散法测定动物病原菌的抑制活性。
（2）动物病原菌的最低抑制浓度（MIC）测定：参照对动物病原菌的抑制活性测定方法，将样品配成一系列浓度，制成一系列浓度的带毒培养平板，37℃条件下培养72h后，观察结果，以不长菌的最低浓度为药液对动物病原菌的MIC。
（3）植物病原真菌菌丝生长的抑制活性测定：参照陈年春[12]采用菌丝生长速率法测定。把样品配成一定浓度的药液（溶剂为丙酮和水，体积比1:1）。在无菌洁净工作台中，把1mL药液（对照组用空白溶剂代替）与9mL热溶马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）混合均匀，倒入直径为9cm的培养皿中制成厚薄均匀的带药培养基。在已活化的供试菌边缘，用直径为0.4cm的无菌打孔器切取菌饼，并接到带药培养基上（菌丝面朝下），每个培养皿接3个菌饼（品字形分布），每个处理设3个重复。置于（27±1）℃光照培养箱中培养72h后，用十字交叉法测量菌落直径，根据下列公式计算抑制率。
抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）÷对照菌落直径×100%
菌落直径（cm）=测量直径-0.4
测定有效中浓度（EC50）时，配制5个系列浓度的药液，测定各个浓度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回归方程、有效中浓度。
17.5.3 实验结果
17.5.3.1 垂穗石松甲醇提取物对15种供试动物病原菌的抑制活性
用带毒培养基法测定垂穗石松甲醇提取物对14种细菌和白色念珠菌的72h抑制活性，结果见表17-2。由表可知，当提取物的浓度为10mg/mL时，其对革兰氏阳性菌的抑制活性较革兰氏阴性菌好。7种革兰氏阳性菌中，只有炭疽杆菌不能被完全抑制；7种革兰氏阴性菌中，只有伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、普通变形杆菌被完全抑制；而该提取物也不能完全抑制白色念珠菌。
17.5.3.2 垂穗石松甲醇提取物对10种供试动物病原菌的最低抑制浓度
基于17.5.3.1节的结果，将垂穗石松甲醇提取物及氯霉素按倍数稀释配成一系列梯
度浓度，制成带毒平板，其中植物提取物终浓度为10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL，氯霉素终浓度为0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.01563mg/mL、0.00781mg/mL、0.00391mg/mL、0.00195mg/mL，测定了不同植物甲醇提取物和氯霉素72h对不同菌的MIC，结果见表17-3。由表可知，氯霉素对10种动物病原菌的活性远好于垂穗石松粗提物的活性，其MIC均在0.0078～0.25mg/mL之间。垂穗石松甲醇提取物对革兰氏阳性菌的抑制效果比革兰氏阴性菌的好。其中，该提取物对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌的抑制效果相对较好。
17.5.3.3 垂穗石松甲醇提取物对9种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性
采用菌丝生长速率法测定了浓度为10mg/mL时垂穗石松甲醇提取物对9种植物病原真菌菌丝72h的抑制活性，结果见表17-4。由表可知，垂穗石松的甲醇提取物能完全抑制烟草黑胫病菌菌丝的生长，对水稻胡麻叶斑病菌菌丝生长具有促进作用，但仅对甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率高于50%。
17.5.3.4 垂穗石松甲醇提取物对供试植物病原真菌菌丝的毒力
为进一步明确垂穗石松甲醇提取物的抑菌效果，基于17.5.3.3节的结果，测定对真菌菌丝生长抑制率大于50%的植物提取物对相应供试病原真菌菌丝的毒力。结果见表17-5。由表可知，垂穗石松提取物对甘蔗凤梨病菌菌丝的毒力最低，EC50为9.9518mg/mL，对烟草黑胫病菌毒力最高，EC50为2.7552mg/mL。
17.5.1 实验材料
植物材料：垂穗石松。
层析试剂：柱层析硅胶（100～200目和200～300目），薄层层析硅胶GF254（青岛海洋化工厂生产）。层析用100～200目中性氧化铝（国药集团化学试剂有限公司生产）。
分析纯：甲醇、丙酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等。
核磁共振所用溶剂：氘代甲醇（CD3OD），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）。
标准对照药剂：125g/L氯霉素注射液（上海现代哈森药业有限公司生产）。
其他常用试剂：氢氧化钠、盐酸、蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白腺、琼脂粉、蒸馏水等。
17.5.2 实验方法
17.5.2.1 植物提取物制备
采用有机溶剂浸提法。植物材料洗净、风干后再烘干至发脆，将其粉碎。用5倍量的甲醇浸泡植物干粉，期间搅拌2～3次，24h后抽滤。浸提2次，将2次滤液合并后用旋转蒸发仪减压浓缩，得膏状粗提物，置于4℃冰箱中保存，备用。
17.5.2.2 植物活性成分分离与鉴定
初步分离：植物材料的甲醇粗提物用液-液萃取法分离。先用二定量的蒸馋水溶解一定质量粗提物，置于分液漏斗中，再加入等量的石油酷，充分摇匀后置于铁架台上静置一段时间，待分层稳定后，用烧杯从分液漏斗下端接水层，石油醚层则从漏斗上部倒出。相同方法萃取三次，合并三次石油醚层，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状并称量。再用同样的方法依次从水层中萃取得到乙酸乙酯层、正丁醇层萃取物。
硅胶层析：植物甲醇粗提物或萃取物先用100～200目硅胶进行柱层析分离，通过薄层层析检测合并相同或相似的馏分，对各组分进行活性测定后确定活性馏分。经过多次硅胶柱层析分离得到以活性化合物为主要物质的馏分，并用中性氧化铝进行层析脱色，再用高效液相色谱仪进行检测、纯化，最终获得纯化合物。
化学结构鉴定：分离得到的化合物，测定并解析其核磁共振谱（NMR）、质谱（MS），再参考相关文献进行结构鉴定。
NMR:以氘代甲醇、氘代DMSO为溶剂，测定1H-NMR，13C-NMR和DEPT135°谱。
MS:采用电子轰击ESI-MS质谱法。
17.5.2.3 生物活性测定
（1）动物病原菌的抑制活性测定：通过带毒平板法和滤纸片扩散法测定动物病原菌的抑制活性。
（2）动物病原菌的最低抑制浓度（MIC）测定：参照对动物病原菌的抑制活性测定方法，将样品配成一系列浓度，制成一系列浓度的带毒培养平板，37℃条件下培养72h后，观察结果，以不长菌的最低浓度为药液对动物病原菌的MIC。
（3）植物病原真菌菌丝生长的抑制活性测定：参照陈年春[12]采用菌丝生长速率法测定。把样品配成一定浓度的药液（溶剂为丙酮和水，体积比1:1）。在无菌洁净工作台中，把1mL药液（对照组用空白溶剂代替）与9mL热溶马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）混合均匀，倒入直径为9cm的培养皿中制成厚薄均匀的带药培养基。在已活化的供试菌边缘，用直径为0.4cm的无菌打孔器切取菌饼，并接到带药培养基上（菌丝面朝下），每个培养皿接3个菌饼（品字形分布），每个处理设3个重复。置于（27±1）℃光照培养箱中培养72h后，用十字交叉法测量菌落直径，根据下列公式计算抑制率。
抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）÷对照菌落直径×100%
菌落直径（cm）=测量直径-0.4
测定有效中浓度（EC50）时，配制5个系列浓度的药液，测定各个浓度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回归方程、有效中浓度。
17.5.3 实验结果
17.5.3.1 垂穗石松甲醇提取物对15种供试动物病原菌的抑制活性
用带毒培养基法测定垂穗石松甲醇提取物对14种细菌和白色念珠菌的72h抑制活性，结果见表17-2。由表可知，当提取物的浓度为10mg/mL时，其对革兰氏阳性菌的抑制活性较革兰氏阴性菌好。7种革兰氏阳性菌中，只有炭疽杆菌不能被完全抑制；7种革兰氏阴性菌中，只有伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、普通变形杆菌被完全抑制；而该提取物也不能完全抑制白色念珠菌。
17.5.3.2 垂穗石松甲醇提取物对10种供试动物病原菌的最低抑制浓度
基于17.5.3.1节的结果，将垂穗石松甲醇提取物及氯霉素按倍数稀释配成一系列梯
度浓度，制成带毒平板，其中植物提取物终浓度为10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL，氯霉素终浓度为0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.01563mg/mL、0.00781mg/mL、0.00391mg/mL、0.00195mg/mL，测定了不同植物甲醇提取物和氯霉素72h对不同菌的MIC，结果见表17-3。由表可知，氯霉素对10种动物病原菌的活性远好于垂穗石松粗提物的活性，其MIC均在0.0078～0.25mg/mL之间。垂穗石松甲醇提取物对革兰氏阳性菌的抑制效果比革兰氏阴性菌的好。其中，该提取物对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌的抑制效果相对较好。
17.5.3.3 垂穗石松甲醇提取物对9种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性
采用菌丝生长速率法测定了浓度为10mg/mL时垂穗石松甲醇提取物对9种植物病原真菌菌丝72h的抑制活性，结果见表17-4。由表可知，垂穗石松的甲醇提取物能完全抑制烟草黑胫病菌菌丝的生长，对水稻胡麻叶斑病菌菌丝生长具有促进作用，但仅对甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率高于50%。
17.5.3.4 垂穗石松甲醇提取物对供试植物病原真菌菌丝的毒力
为进一步明确垂穗石松甲醇提取物的抑菌效果，基于17.5.3.3节的结果，测定对真菌菌丝生长抑制率大于50%的植物提取物对相应供试病原真菌菌丝的毒力。结果见表17-5。由表可知，垂穗石松提取物对甘蔗凤梨病菌菌丝的毒力最低，EC50为9.9518mg/mL，对烟草黑胫病菌毒力最高，EC50为2.7552mg/mL。
