宁德市图书馆 内容
5.5.3.1 抗肿瘤活性体外研究
1）细胞培养与样品溶液配制
a.细胞培养
将肝癌细胞株BEL-7404培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每隔48h更换新鲜培养基。每隔2～3天使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。实验中选取处于对数生长期的细胞用于实验。
b.样品溶液配制
将毛花猕猴桃根氯仿层冻干粉末溶于DMSO配制成40mg/mL的母液，12000r/min，10min离心，取上清液，过滤除菌后分装待用。
2）毛花猕猴桃根氯仿层对肝癌细胞BEL-7404生长的影响
取对数生长期的BEL-7404接种于96孔板内，每孔加入190μL细胞液，调整细胞密度，使每孔种入3000个细胞。接种后培养8h，待细胞贴壁后，使用培养基将药物配制成不同浓度，每孔加入10μL药物，使其终质量浓度分别为112.5μg/mL，87.5μg/mL，62.5μg/mL，每组设置3个复孔，同时设置终浓度为0.5%DMSO溶剂对照组和终质量浓度分别为3.325μg/mL，0.3325μg/mL，0.03325μg/mL的紫杉醇阳性对照组。自加入化合物Oh、24h、48h、72h、120h、144h，使用胰蛋白酶消化，收集细胞，加入台盼蓝排除死细胞，对每组分别进行计数，所得数据绘制生长曲线（图5-9、图5-10）。
3）毛花猕猴桃根氯仿层对肝癌细胞BEL-7404和正常细胞LO2增殖抑制作用
取对数生长期的BEL-7404、LO2细胞接种于96孔板内，每孔加入190μL细胞液，调整细胞密度，使每孔种入3000个细胞。接种后培养8h，待细胞贴壁后，使用培养基将药物配制成不同浓度，每孔加入10μL药物，使其终质量浓度分别为200μg/mL，175μg/mL，150μg/mL，137.5μg/mL，125μg/mL，112.5μg/mL，100μg/mL，87.5μg/mL，每组设置3个复孔，同时设置终浓度为0.5%DMSO溶剂对照组和终质量浓度分别为3.325μg/mL，1.663|μg/mL，3.325×10-1μg/mL，1.663×10-1|μg/mL，3.325×10-2μg/mL，1.663×10-2μg/mL的紫杉醇阳性对照组。将加药后的96孔板放回培养箱中继续培养72h，取出培养板，每孔加入新鲜配制的0.5mg/mLMTT10μL，继续培养4h，取出培养板，离心3000r/min，10min，吸弃上清液，每孔加入150μLDMSO，于摇床上摇动10min，充分溶解所形成的甲瓒，用酶标仪在490nm处测定各孔吸光度（A），计算样品对细胞生长的抑制率，并计算IC50值。实验重复3次。使用下列公式计算抑制率：
抑制率%=对照组吸光度A均值-实验组吸光度A均值/对照组吸光度A均值-凋零组吸光度A均值×100%
在所设定的87.5～20μg/mL给药浓度范围内，毛花猕猴桃根氯仿层对肝癌细胞株BEL-7404有显著的增殖抑制作用，结果如表5-2所示，由表中数据可知，随着给药浓度的增高，氯仿层对BEL-7404的抑制率越高，可见氯仿层对BEL-7404的抑制作用呈剂量依赖性关系。在200μg/mL给药浓度下作用72h抑制率达到85%以上，半抑制浓度IC50约为114.8日μg/mL。阳性对照药紫杉醇组呈现相似的抑制规律，其半抑制浓度IC50约为6.999×10-1μg/mL。
结果如表5-2所示，在112.5～200μg/mL浓度范围内，毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2有显著的增殖抑制作用，随着给药浓度的增高，氯仿层对LO2的抑制率越高；当浓度下降到100μg/mL以下时，毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2的增殖抑制作用不再明显。同时，由表中数据可知，当给药浓度低于150μg/mL时，毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2的增殖抑制作用要明显小于对肝癌细胞株BEL-7404的增殖抑制作用。计算所得毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2的半抑制浓度IC50约为132.2μg/mL。紫杉醇组除最大浓度组外，其他各组对LO2的抑制作用不明显。
5.5.3.2 抗肿瘤活性体内研究
1）实验方法
a.样品溶液配制
称取适量的灭菌后的氯仿层粉末将其混悬于含10%吐温-80的生理盐水中，配制成均匀的混悬液。
b.H22小鼠肝癌实体瘤模型的建立
抽取小鼠腹水：腹腔注射连续继代3代以上的H22细胞株，选择接种后7～10天，选取肿瘤腹水长势良好的H22肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，固定，腹部用碘酒、酒精消毒后，用5mL无菌注射器抽取小鼠腹水，计数，加入台盼蓝检测细胞存活状态，存活率应高于95%。将腹水转移至无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000r/min，5min），弃上清液，加入适量无菌生理盐水，将细胞密度调整至l×l0⁷个/mL，待用。
实体瘤接种：选取健康的ICR小鼠60只，逐个称重，随机选中50只，每只小鼠右腋下皮肤用碘酒、酒精消毒后，以1mL无菌注射器，在无菌条件下，吸取上步制备的细胞悬液0.2mL，注射于小鼠右腋皮下。全程无菌操作，40min内完成接种。
c.分组与给药
在小鼠接种瘤细胞24h后，将50只小鼠随机分成5组，每组10只，分笼饲养，每天定时灌胃给药。另设正常健康的ICR小鼠10只为正常组，各组均自由摄食与饮水，分组灌胃情况如下:①模型对照组，溶剂灌胃，每日一次。②阳性对照组，每天为其进行5-FulOmg/kg腹腔注射，每日一次。③正常组，健康ICR小鼠，溶剂灌胃，每日一次。④药物高剂量组，300mg/kg，灌胃给药，每日一次。⑤药物中剂量组，150mg/kg，灌胃给药，每日一次。⑥药物低剂量组，75mg/kg，灌胃给药，每日一次。
除正常组外，各组均连续灌胃给药10天，停药次日，称取小鼠体重，处死小鼠，用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤，用手术剪剪开皮肤，暴露肿瘤，用镊子钝性剥离肿瘤，电子天平称量瘤重，同时测量肿瘤的长径和短径，逐一记录。
d.指标检测
小鼠体重变化：比较各组小鼠在实验前和处死前体重变化情况，对其生长状况进行观测。
瘤体积：瘤体积的计算按照下列公式
瘤体积（V）=瘤长径（a）×瘤短径（b）²/2
计算各组抑瘤率：抑瘤率％=对照组平均瘤种-治疗组平均瘤种/对照组平均瘤种×100％
2）实验结果分析
a.毛花猕猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠生长的影响
体重：小鼠接种肿瘤前的体重和处理小鼠时的体重以及给药后的存活率如表5-3所示。从表中数据可知，与正常组小鼠和模型对照组小鼠相比，氯仿层处理高、中、低剂量的小鼠体重未出现明显变化，阳性对照组小鼠体重明显下降。
存活率：如表5-3中数据所示，氯仿层处理高、中、低剂量组，均有小鼠死亡，而阳性对照组、模型组、正常组小鼠均未出现死亡现象。
b.毛花猕猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠肿瘤的抑制作用
毛花狒猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠肿瘤体积影响：毛花猕猴桃根氯仿层作用于H22肝癌小鼠后，对H22肝癌小鼠体内肿瘤体积的影响如表5-4所示。低剂量组对H22肝癌小鼠的肿瘤体积有着明显的抑制作用；高、中剂量组对肿瘤体积的抑制作用不明显；阳性对照组呈现明显的抑制作用。
毛花猕猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠肿瘤抑瘤率影响：毛花猕猴桃根氯仿层作用于H22肝癌小鼠后，低剂量组对H22肝癌小鼠肿瘤有着明显的抑制作用，抑瘤率为37.34%；高、中剂量组对肿瘤的抑制作用不明显；阳性对照组对H22肝癌小鼠肿瘤有着明显的抑制作用，抑瘤率为37.17%，如表5-5所示。
p<0.05，与对照组相比。
1）细胞培养与样品溶液配制
a.细胞培养
将肝癌细胞株BEL-7404培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每隔48h更换新鲜培养基。每隔2～3天使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。实验中选取处于对数生长期的细胞用于实验。
b.样品溶液配制
将毛花猕猴桃根氯仿层冻干粉末溶于DMSO配制成40mg/mL的母液，12000r/min，10min离心，取上清液，过滤除菌后分装待用。
2）毛花猕猴桃根氯仿层对肝癌细胞BEL-7404生长的影响
取对数生长期的BEL-7404接种于96孔板内，每孔加入190μL细胞液，调整细胞密度，使每孔种入3000个细胞。接种后培养8h，待细胞贴壁后，使用培养基将药物配制成不同浓度，每孔加入10μL药物，使其终质量浓度分别为112.5μg/mL，87.5μg/mL，62.5μg/mL，每组设置3个复孔，同时设置终浓度为0.5%DMSO溶剂对照组和终质量浓度分别为3.325μg/mL，0.3325μg/mL，0.03325μg/mL的紫杉醇阳性对照组。自加入化合物Oh、24h、48h、72h、120h、144h，使用胰蛋白酶消化，收集细胞，加入台盼蓝排除死细胞，对每组分别进行计数，所得数据绘制生长曲线（图5-9、图5-10）。
3）毛花猕猴桃根氯仿层对肝癌细胞BEL-7404和正常细胞LO2增殖抑制作用
取对数生长期的BEL-7404、LO2细胞接种于96孔板内，每孔加入190μL细胞液，调整细胞密度，使每孔种入3000个细胞。接种后培养8h，待细胞贴壁后，使用培养基将药物配制成不同浓度，每孔加入10μL药物，使其终质量浓度分别为200μg/mL，175μg/mL，150μg/mL，137.5μg/mL，125μg/mL，112.5μg/mL，100μg/mL，87.5μg/mL，每组设置3个复孔，同时设置终浓度为0.5%DMSO溶剂对照组和终质量浓度分别为3.325μg/mL，1.663|μg/mL，3.325×10-1μg/mL，1.663×10-1|μg/mL，3.325×10-2μg/mL，1.663×10-2μg/mL的紫杉醇阳性对照组。将加药后的96孔板放回培养箱中继续培养72h，取出培养板，每孔加入新鲜配制的0.5mg/mLMTT10μL，继续培养4h，取出培养板，离心3000r/min，10min，吸弃上清液，每孔加入150μLDMSO，于摇床上摇动10min，充分溶解所形成的甲瓒，用酶标仪在490nm处测定各孔吸光度（A），计算样品对细胞生长的抑制率，并计算IC50值。实验重复3次。使用下列公式计算抑制率：
抑制率%=对照组吸光度A均值-实验组吸光度A均值/对照组吸光度A均值-凋零组吸光度A均值×100%
在所设定的87.5～20μg/mL给药浓度范围内，毛花猕猴桃根氯仿层对肝癌细胞株BEL-7404有显著的增殖抑制作用，结果如表5-2所示，由表中数据可知，随着给药浓度的增高，氯仿层对BEL-7404的抑制率越高，可见氯仿层对BEL-7404的抑制作用呈剂量依赖性关系。在200μg/mL给药浓度下作用72h抑制率达到85%以上，半抑制浓度IC50约为114.8日μg/mL。阳性对照药紫杉醇组呈现相似的抑制规律，其半抑制浓度IC50约为6.999×10-1μg/mL。
结果如表5-2所示，在112.5～200μg/mL浓度范围内，毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2有显著的增殖抑制作用，随着给药浓度的增高，氯仿层对LO2的抑制率越高；当浓度下降到100μg/mL以下时，毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2的增殖抑制作用不再明显。同时，由表中数据可知，当给药浓度低于150μg/mL时，毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2的增殖抑制作用要明显小于对肝癌细胞株BEL-7404的增殖抑制作用。计算所得毛花猕猴桃根氯仿层对人正常肝细胞LO2的半抑制浓度IC50约为132.2μg/mL。紫杉醇组除最大浓度组外，其他各组对LO2的抑制作用不明显。
5.5.3.2 抗肿瘤活性体内研究
1）实验方法
a.样品溶液配制
称取适量的灭菌后的氯仿层粉末将其混悬于含10%吐温-80的生理盐水中，配制成均匀的混悬液。
b.H22小鼠肝癌实体瘤模型的建立
抽取小鼠腹水：腹腔注射连续继代3代以上的H22细胞株，选择接种后7～10天，选取肿瘤腹水长势良好的H22肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，固定，腹部用碘酒、酒精消毒后，用5mL无菌注射器抽取小鼠腹水，计数，加入台盼蓝检测细胞存活状态，存活率应高于95%。将腹水转移至无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000r/min，5min），弃上清液，加入适量无菌生理盐水，将细胞密度调整至l×l0⁷个/mL，待用。
实体瘤接种：选取健康的ICR小鼠60只，逐个称重，随机选中50只，每只小鼠右腋下皮肤用碘酒、酒精消毒后，以1mL无菌注射器，在无菌条件下，吸取上步制备的细胞悬液0.2mL，注射于小鼠右腋皮下。全程无菌操作，40min内完成接种。
c.分组与给药
在小鼠接种瘤细胞24h后，将50只小鼠随机分成5组，每组10只，分笼饲养，每天定时灌胃给药。另设正常健康的ICR小鼠10只为正常组，各组均自由摄食与饮水，分组灌胃情况如下:①模型对照组，溶剂灌胃，每日一次。②阳性对照组，每天为其进行5-FulOmg/kg腹腔注射，每日一次。③正常组，健康ICR小鼠，溶剂灌胃，每日一次。④药物高剂量组，300mg/kg，灌胃给药，每日一次。⑤药物中剂量组，150mg/kg，灌胃给药，每日一次。⑥药物低剂量组，75mg/kg，灌胃给药，每日一次。
除正常组外，各组均连续灌胃给药10天，停药次日，称取小鼠体重，处死小鼠，用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤，用手术剪剪开皮肤，暴露肿瘤，用镊子钝性剥离肿瘤，电子天平称量瘤重，同时测量肿瘤的长径和短径，逐一记录。
d.指标检测
小鼠体重变化：比较各组小鼠在实验前和处死前体重变化情况，对其生长状况进行观测。
瘤体积：瘤体积的计算按照下列公式
瘤体积（V）=瘤长径（a）×瘤短径（b）²/2
计算各组抑瘤率：抑瘤率％=对照组平均瘤种-治疗组平均瘤种/对照组平均瘤种×100％
2）实验结果分析
a.毛花猕猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠生长的影响
体重：小鼠接种肿瘤前的体重和处理小鼠时的体重以及给药后的存活率如表5-3所示。从表中数据可知，与正常组小鼠和模型对照组小鼠相比，氯仿层处理高、中、低剂量的小鼠体重未出现明显变化，阳性对照组小鼠体重明显下降。
存活率：如表5-3中数据所示，氯仿层处理高、中、低剂量组，均有小鼠死亡，而阳性对照组、模型组、正常组小鼠均未出现死亡现象。
b.毛花猕猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠肿瘤的抑制作用
毛花狒猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠肿瘤体积影响：毛花猕猴桃根氯仿层作用于H22肝癌小鼠后，对H22肝癌小鼠体内肿瘤体积的影响如表5-4所示。低剂量组对H22肝癌小鼠的肿瘤体积有着明显的抑制作用；高、中剂量组对肿瘤体积的抑制作用不明显；阳性对照组呈现明显的抑制作用。
毛花猕猴桃根氯仿层对H22肝癌小鼠肿瘤抑瘤率影响：毛花猕猴桃根氯仿层作用于H22肝癌小鼠后，低剂量组对H22肝癌小鼠肿瘤有着明显的抑制作用，抑瘤率为37.34%；高、中剂量组对肿瘤的抑制作用不明显；阳性对照组对H22肝癌小鼠肿瘤有着明显的抑制作用，抑瘤率为37.17%，如表5-5所示。
p<0.05，与对照组相比。
