宁德市图书馆 内容
本研究组曾对地稔乙醇提取部位开展化学成分以及抗炎活性的研究。我们共发现了18个化合物（图2-9），包括4个三萜类化合物（1～3，6），3个甾体类化合物（4，5，14），7个黄酮类化合物（7～9，12，13，15，16），3个单宁类化合物（10，11，17）和1个脑苷脂类化合物（18），并对它们的抗炎活性进行了测试。在此，本节将阐述地稔植物中化学成分的分离纯化、结构鉴定，以及药理活性测试方面的内容。
2.5.1 地稔中化学成分的提取与分离
2.5.1.1 植物来源
地稔于2010年采于浙江省丽水市，经第二军医大学黄宝康副教授鉴定为地稔的干燥全草，标本保存于复旦大学药学院天然药物化学教研室。
2.5.1.2 提取分离流程
地稔非挥发性成分的提取分离过程实验流程图，见图2-10。
2.5.2 地稔中特征化合物的结构鉴定
2.5.2.1 化合物2的结构鉴定
化合物2（白桦酸）为白色粉末。13C-NMR谱（图2-12）数据给出了30个碳原子的信号。因此推测其可能是个三萜。化学位移为79.4的仲碳提示这个化合物可能含有一个羟基。化学位移为180.1的碳信号提示此化合物含有1个竣基。e-NMR谱（图2-11）上可以看出有6个单峰甲基，其中一个甲基化学位移为1.80，因此怀疑这个甲基是烯丙位的甲基。低场区域显示出两个单峰的烯氢的信号，其化学位移为4.78、4.96，显示其中包含了一个末端双键。因此进一步怀疑其可能为羽扇豆烷型三萜。DEPT（无畸变极化转移增强）谱显示其中包含6个甲基，11个亚甲基，6个次甲基和7个季碳。再结合质谱上出现455.1的[M-H]峰，911.4的[2M-H]峰，推测其分子量为456，分子式为C30H4803。根据以上的推测再与文献[40]对照得出结论，化合物2为白桦酸。数据对照参见表2-2和表2-3。
2.5.2.2 化合物5的结构鉴定
化合物5（daucosterol6-O-eicosanoate）为白色粉末。1H-NMR谱（图2-13）上0.68和1.01的单峰甲基以及化学位移在两者之间的四个甲基的复杂裂分显示出甾体母核的存在。化学位移为5.28的宽峰信号以及l3C-NMR谱上的140.4、122.3的两个信号显示出该化合
物存在环内双键。13C-NMR谱（图2-14）上化学位移为79.7、101.3、73.7、76.1、70.2、
74.1、63.3以及氢谱上化学位移为4.38，耦合常数为8.0Hz的一组信号显示出该化合物包含有一个β-D-吡喃葡萄糖基团，还有1个信号是甾体母核上3位碳的信号。同时13C-NMR谱上多出的14.3、22.7、34.4、174.9的一组信号显示出长链脂肪酸的存在。根据其与β-sitosterol-3-O-glycoside在5′，6′位碳的化学位移的差异，以及与参考文献[41，42]的比较（表2-4和表2-5），我们确定了脂肪链是连在6′位的。根据质谱的信号869.7（[M-H]-），我们最终确定该化合物为daucosterol6′-O-eicosanoate。
252.3 化合物11的结构鉴定
化合物11[槲皮素-3-O-β-D-（6"-没食子酰）吡喃葡萄糖苷]为黄色粉末1H-NMR谱（图2-15）上化学位移为7.55、7.41、6.68的三个氢构成ABX自旋体系。结合6.35、6.14两个化学化移信号，我们推测有槲皮素母核的存在。1H-NMR谱上5.41以及13C-NMR（图2-16）上101.9、74.5、76.7、69.9、74.7、63.5这几个信号提示我们β-D-吡喃葡萄糖基团的存在。1H-NMR谱上6.86的两氢单峰以及13C-NMR谱上119.5、109.0、139.1、145.9、
166.2这几个信号表明有没食子酰基的存在。与己知文献[43]对比，最终确定化合物11为槲皮素-3-O-β-D-（6"-没食子酰）吡喃葡萄糖苷。与已知文献对照参见表2-6和表2-7。
2.5.3 地稔中化合物抗炎活性的测定
2.5.3.1 实验方法
体外炎症模型（IL-1β刺激HT-29的炎症模型）的建立:96孔板每孔加入100μLHT-29细胞液（含血清的McCoy's5A培养液），控制细胞数3.5×104个/孔，置于CO2培养箱。1天后，吸掉培养液，然后每孔加入200μLPBS洗涤，振荡，吸掉洗涤液。分别加入100μL不含血清的McCoy's5A培养液并重新置入CO2培养箱，过夜。待细胞饥饿24h后，加入待测样品并同时以白细胞介素-1β（IL-1B）（1Ong/mL）进行刺激，CO2培养箱过夜后以ELISA试剂盒检测炎症因子白细胞介素-8（IL-8）的生成情况。每个样品做3个复孔，取平均值。
2.5.3.2 实验结果
初步筛选发现，地稔乙醇提取物在体外能抑制IL-8的生成。石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相均具有一定活性，如图2-17所示。
我们选择了乙酸乙酯相进行分离，并最终得到了18个化合物。初步实验显示，化合物l（hhwl）、10（hhw7）、11（hhw8）在HT-29细胞模型中对IL-Ip诱导的IL-8的生成具有明显抑制作用，如图2-18所示。
2.5.4 实验讨论与总结
初步筛选地稔乙醇提取物的各有机相在体外对IL-8的活性，发现地稔乙酸乙酯相具有较好的IL-8的抑制活性。进一步对该部位进行纯化分离，共获得18个单体化合物，包括4个三萜类化合物（1～3，6），3个甾体类化合物（4.5，14），7个黄酮类化合物（7～9，12.13，15，16），3个单宁类化合物（10，11，17）和1个脑苷脂类化合物（18），并分别对它们的抗炎活性进行了测试。药理活性数据表明，化合物1、10和11在HT-29细胞模型中对IL-1β诱导的IL-8的生成具有明显抑制作用。
2.5.1 地稔中化学成分的提取与分离
2.5.1.1 植物来源
地稔于2010年采于浙江省丽水市，经第二军医大学黄宝康副教授鉴定为地稔的干燥全草，标本保存于复旦大学药学院天然药物化学教研室。
2.5.1.2 提取分离流程
地稔非挥发性成分的提取分离过程实验流程图，见图2-10。
2.5.2 地稔中特征化合物的结构鉴定
2.5.2.1 化合物2的结构鉴定
化合物2（白桦酸）为白色粉末。13C-NMR谱（图2-12）数据给出了30个碳原子的信号。因此推测其可能是个三萜。化学位移为79.4的仲碳提示这个化合物可能含有一个羟基。化学位移为180.1的碳信号提示此化合物含有1个竣基。e-NMR谱（图2-11）上可以看出有6个单峰甲基，其中一个甲基化学位移为1.80，因此怀疑这个甲基是烯丙位的甲基。低场区域显示出两个单峰的烯氢的信号，其化学位移为4.78、4.96，显示其中包含了一个末端双键。因此进一步怀疑其可能为羽扇豆烷型三萜。DEPT（无畸变极化转移增强）谱显示其中包含6个甲基，11个亚甲基，6个次甲基和7个季碳。再结合质谱上出现455.1的[M-H]峰，911.4的[2M-H]峰，推测其分子量为456，分子式为C30H4803。根据以上的推测再与文献[40]对照得出结论，化合物2为白桦酸。数据对照参见表2-2和表2-3。
2.5.2.2 化合物5的结构鉴定
化合物5（daucosterol6-O-eicosanoate）为白色粉末。1H-NMR谱（图2-13）上0.68和1.01的单峰甲基以及化学位移在两者之间的四个甲基的复杂裂分显示出甾体母核的存在。化学位移为5.28的宽峰信号以及l3C-NMR谱上的140.4、122.3的两个信号显示出该化合
物存在环内双键。13C-NMR谱（图2-14）上化学位移为79.7、101.3、73.7、76.1、70.2、
74.1、63.3以及氢谱上化学位移为4.38，耦合常数为8.0Hz的一组信号显示出该化合物包含有一个β-D-吡喃葡萄糖基团，还有1个信号是甾体母核上3位碳的信号。同时13C-NMR谱上多出的14.3、22.7、34.4、174.9的一组信号显示出长链脂肪酸的存在。根据其与β-sitosterol-3-O-glycoside在5′，6′位碳的化学位移的差异，以及与参考文献[41，42]的比较（表2-4和表2-5），我们确定了脂肪链是连在6′位的。根据质谱的信号869.7（[M-H]-），我们最终确定该化合物为daucosterol6′-O-eicosanoate。
252.3 化合物11的结构鉴定
化合物11[槲皮素-3-O-β-D-（6"-没食子酰）吡喃葡萄糖苷]为黄色粉末1H-NMR谱（图2-15）上化学位移为7.55、7.41、6.68的三个氢构成ABX自旋体系。结合6.35、6.14两个化学化移信号，我们推测有槲皮素母核的存在。1H-NMR谱上5.41以及13C-NMR（图2-16）上101.9、74.5、76.7、69.9、74.7、63.5这几个信号提示我们β-D-吡喃葡萄糖基团的存在。1H-NMR谱上6.86的两氢单峰以及13C-NMR谱上119.5、109.0、139.1、145.9、
166.2这几个信号表明有没食子酰基的存在。与己知文献[43]对比，最终确定化合物11为槲皮素-3-O-β-D-（6"-没食子酰）吡喃葡萄糖苷。与已知文献对照参见表2-6和表2-7。
2.5.3 地稔中化合物抗炎活性的测定
2.5.3.1 实验方法
体外炎症模型（IL-1β刺激HT-29的炎症模型）的建立:96孔板每孔加入100μLHT-29细胞液（含血清的McCoy's5A培养液），控制细胞数3.5×104个/孔，置于CO2培养箱。1天后，吸掉培养液，然后每孔加入200μLPBS洗涤，振荡，吸掉洗涤液。分别加入100μL不含血清的McCoy's5A培养液并重新置入CO2培养箱，过夜。待细胞饥饿24h后，加入待测样品并同时以白细胞介素-1β（IL-1B）（1Ong/mL）进行刺激，CO2培养箱过夜后以ELISA试剂盒检测炎症因子白细胞介素-8（IL-8）的生成情况。每个样品做3个复孔，取平均值。
2.5.3.2 实验结果
初步筛选发现，地稔乙醇提取物在体外能抑制IL-8的生成。石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相均具有一定活性，如图2-17所示。
我们选择了乙酸乙酯相进行分离，并最终得到了18个化合物。初步实验显示，化合物l（hhwl）、10（hhw7）、11（hhw8）在HT-29细胞模型中对IL-Ip诱导的IL-8的生成具有明显抑制作用，如图2-18所示。
2.5.4 实验讨论与总结
初步筛选地稔乙醇提取物的各有机相在体外对IL-8的活性，发现地稔乙酸乙酯相具有较好的IL-8的抑制活性。进一步对该部位进行纯化分离，共获得18个单体化合物，包括4个三萜类化合物（1～3，6），3个甾体类化合物（4.5，14），7个黄酮类化合物（7～9，12.13，15，16），3个单宁类化合物（10，11，17）和1个脑苷脂类化合物（18），并分别对它们的抗炎活性进行了测试。药理活性数据表明，化合物1、10和11在HT-29细胞模型中对IL-1β诱导的IL-8的生成具有明显抑制作用。
