宁德市图书馆 内容
柳叶蜡梅中生物碱成分的提取和分离
在蜡梅属其他不少植物中，文献报道了蜡梅碱、山蜡梅碱等生物碱类化合物的发现。由于生物碱具有与其他非挥发性成分不同的性质，它具有弱碱性、易被常规分离材料吸附，故生物碱成分的分离采用特殊的分离材料和分离流程。
1.5.2.1 总生物碱的提取
总生物碱的提取常用方法有溶剂法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、渗漉薄膜蒸发连续提取法和超临界流体萃取法。对于已报道的蜡梅属总生物碱部位的提取主要采用的是溶剂法。溶剂法主要包括水直接提取、酸水-有机溶剂提取、醇提取、碱化-有机溶剂提取以及以上相结合的方法。
1）水直接提取
直接以水作为提取溶剂，操作简单，成本较低，水提液经喷雾干燥得到总碱提取物。
但是该法在提取生物碱成分时，也会带入大量其他非生物碱的水溶性物质，为后面的生物碱的进一步分离纯化带来极大的困难。不适用于含大量淀粉和水溶性蛋白的植物。
2）酸水-有机溶剂提取
具有碱性的生物碱在植物体中多以盐的形式存在，而弱碱性或呈中性的生物碱多以不稳定的盐以及游离碱的形式存在。故常用弱酸为溶剂将生物碱成分转化为盐的形式，采用酸水提取。
3）醇提取
游离形式存在的生物碱或以盐形式存在的生物碱一般都能溶于醇溶液，因而采用醇提法提取生物碱成分较为普遍。
4）碱化-有机溶剂提取
对于以盐的形式存在的生物碱，预先用碱水处理，可将其转化为游离的形式，再采用有机溶剂进行提取。
5）酸水-碱化-亲脂性溶剂提取
该法在实验室中较为常用，使用于大多数生物碱成分的提取。经过酸水处理，将植物中的生物碱成分都转化为盐的形式，经酸水提出后，再进行碱化，将生物碱转化为游离的形式，最终采用亲脂性溶剂，将总碱部位提出。如蜡梅中生物碱的提取，先采用甲醇对药材浸提4次，获得的浸提物经10%的乙酸溶液溶解，通过乙酸乙酯萃取多次，获得的水相部位经Na2cCO3处理（pH=10），再采用氯仿萃取方法，最终获得总碱成分叫[28]
1.5.2.2 单体生物碱的分离和结构解析
总生物碱的进一步分离纯化，一直是天然产物化学中的一个难点。目前实验室中多采用色谱分离法，包括采用硅胶吸附剂、氧化铝分离材料、反相材料或葡聚糖凝胶等，半制备的HPLC也越来越普及，适用于碱性物质分离的色谱柱也被大量研制出来。
蜡梅属植物中富含生物碱类化学成分，目前已从其他蜡梅属植物中获得的生物碱单
体化合物有（+）-calycanthine、（一）-calycanthidine、（一）-chimonanthine、（一）-chimonanthidine、（一）-fblicanthine、（+）-calycanthidine、（+）-chimonanthine、（+）-fblicanthine、chimonamidine>CPC-1、CPC-2、meso-chimonanthine、tryptamine、Na，Nb-dimethyitryptamine、3-methy-Icarboxymethyl-indole-l-N-β-D-glucopyranoxide[52]。本项目组对柳叶蜡梅的生物碱类化学成分进行细致的研究，共发现8个生物碱单体化合物salicifoxazineA、salicifoxazineB、（一）-chimonanthine、meso-chimonanthine、（—）-fblicanthine、（+）-caIycanthine、（一）-iso-calycanthine和（3aR，3'aR，8-8a，8′-8′a）-tetradehydroisocalycanthine，其中salicifoxazineA和salicifoxazineB是一类具有新颖的氮氧结构片段的全新生物碱（图1-8）[31]。
1）化合物（一）-chimonanthidine的结构鉴定
（一）-chimonanthidine具有二聚吡咯并口吲哚结构，广泛分布于蜡梅属的植物中。（一）-chimonanthidine的结构鉴定过程如下：
无定形粉末；[a]20-285°（c0.05，EtOH）；HR-FABMSm/z361.2392[M+H]+，确定分子式为C23H28N4该分子式中包含12个不饱和度。1H4-NMR图谱中，3个甲基质δ2.36、2.84、2.98分别连接于氮原子上，结合13C-NMR图谱信息，该生物碱与已知生物碱chimonanthine、folicanthine、calycanthidine等具有相同的二聚吡咯并口吲哚型骨架。（一）-chimonanthidine的结构进一步通过二维以及合成的方法确定。（一）-chimonanthidine的绝对构型进一步通过与己知化合物（一）-fblicanthine的圆二色谱（CD）对比确定（图1-9）。
（一）-chimonanthidine1H-NMRCCDCh，600MHz）:2.03～2.07QH，m，H-3，3'），2.24～2.3I（1H，m，H-3'），2.36（3H，s，M-C%），2.44-2.51（3H，m，H-2，3，2'），2.61～2.64（1H，m，H-2），2.84（3H，s，N8′-CH3）2.94～2.97（1H，m，H-2'），2.98（3H，s，M-CH3），4.18（1H，br-s，H-8a），4.58（1H，br-s，H-8'a），6.24（1H，d，J=8.1Hz，H-7'），6.34（1H，d，J=7.8Hz，H-7），6.52（1H，dd，J=7.4Hz，7.4Hz，H-5'），6.56（1H，dd，J=7.6Hz，7.6Hz，H-5），7.00～7.06（4H，m，H-4，6，4'，6'）；i3c-NMR（CDCh，150MHz）:31.1（%'（此），35.0（C-3），35.3（N8-CH3），38.2（C-3'），38.3（N1-CH3），45.6（C-2'），53.0（C-2），62.4（C-3a，3'a），87.2（C-8'a），92.5（C-8a），104.7（C-7，），106.2（C-7），106.2（C-5'），116.9（C-5），124.3（C-4'），124.4（C-4），128.4（06，6'），131.8（C-3'b），132.6（C-3b），152.5（C-7′a），152.8（C-7a）。
2）化合物salicifoxazineA和salicifoxazineB的结构鉴定
SalicifoxazineA为淡黄色油状物，HR-ESIMSm/z363.2176[M+H]+，确定分子式为C22H26N4O。，H-NMR和13C-NMR谱中（表1-11）包含了两套相似的信号，意味着该生物碱可能为二聚化合物。在1H-NMR谱中显示以下官能团的信号：两个单峰连氮甲基质子（δ2.27，2.41；N1-Me，N，-Me）；四个亚甲基质子（δ2.44，m，H2-2；δ2.63，ddd，Ha-3；δ1.71，dt，J=11.8Hz，4.9Hz，Hb-3；δ2.66，ddd，overlapped，Ha-2'；62.33，td，J=11.3Hz，3.5Hz，Hb-2；δ2.45，m，Ha-3；δ2.02，dddJ=13.3Hz，3.5Hz，2.2Hz，Hb-3′）；两个连着杂原子的次甲基质子（δ4.47，brs，H-8a；δ5.11，brs，H-8a′）；两对AA′BB′系统的芳香氢原子信号（δ7.16，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4；δ6.74，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5；δ7.07，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6；δ6.61，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7和δ7.21，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4'；δ6.86，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5'；57.17，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6'；56.71，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7′）。与之相对应的碳谱显示了22个碳信号：两个连氮甲基（δ37.2和46.3）；四个亚甲基（δ52.9和34.3；δ53.8和27.3）；两个季碳信号（δ64.1和50.9）；链各个连接杂原子的次甲基（δ85.2和93.2）；两对邻位取代的苯环（δ125.7，118.6，128.3，109.2，151.1，132.3；δ125.1，118.8，128.5，109.5，151.1，129.4）。此外，紫外吸收光谱中241nm和298nm处的吸收波长表明PhNCN发射官能团的存在。
上述NMR数据与已知化合物（一）-chimonanthine有着高度相似，说明salicifoxazineA也是一个二聚色胺生物碱。与（一）-chimonanthine不同的是，㈠-chimonanthine中N1-Me的化学位移在37.4，而salicifoxazineA的在46.3，（一）-chimonanthine中C-8a，在&85.6，而salicifoxazineA的在&93.2。这两个向低场迁移的信号，说明N1和C-8a′之间插入了一个氧原子，从而形成具有独特的嗪六元环的结构。由此可以推断出salicifoxazineA的平面结构。
止匕外，salicifoxazineA的旋光值为[a]-243.9。（c-0.37，MeOH），该值与已知化合物（一）-chimonanthine[a]20-310°（c0.80，EtOH）和（一）-chimonanthidine[a]20-285°（c0.05，EtOH）相近。进一步测定salicifoxazineA的CD图谱（图1-10），其CD图谱与已知化合物（一）-chimonanthidine（图1-9）相似。由此可以推断出salicifoxazineA的结构如图1-8所示。
SalicifbxazineB的HR-ES1MSm/z385.1995[M+Na]+，确定分子式为C22H26N4O，且其NMR图谱与salicifbxazineA的高度相似，可知salicifoxazineB的平面结构与salicifoxazineA相同。与salicifoxazineA不同的是，salicifoxazineB的旋光值为[a]20-2.2°，该值与meso-chimonanthine的[a]20相近。此外，salicifbxazineB的CD图谱并未见明显的Cotton效应，且手性柱分析该化合物为手性纯化合物，说明salicifoxazineB为内消旋化合物。
在蜡梅属其他不少植物中，文献报道了蜡梅碱、山蜡梅碱等生物碱类化合物的发现。由于生物碱具有与其他非挥发性成分不同的性质，它具有弱碱性、易被常规分离材料吸附，故生物碱成分的分离采用特殊的分离材料和分离流程。
1.5.2.1 总生物碱的提取
总生物碱的提取常用方法有溶剂法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、渗漉薄膜蒸发连续提取法和超临界流体萃取法。对于已报道的蜡梅属总生物碱部位的提取主要采用的是溶剂法。溶剂法主要包括水直接提取、酸水-有机溶剂提取、醇提取、碱化-有机溶剂提取以及以上相结合的方法。
1）水直接提取
直接以水作为提取溶剂，操作简单，成本较低，水提液经喷雾干燥得到总碱提取物。
但是该法在提取生物碱成分时，也会带入大量其他非生物碱的水溶性物质，为后面的生物碱的进一步分离纯化带来极大的困难。不适用于含大量淀粉和水溶性蛋白的植物。
2）酸水-有机溶剂提取
具有碱性的生物碱在植物体中多以盐的形式存在，而弱碱性或呈中性的生物碱多以不稳定的盐以及游离碱的形式存在。故常用弱酸为溶剂将生物碱成分转化为盐的形式，采用酸水提取。
3）醇提取
游离形式存在的生物碱或以盐形式存在的生物碱一般都能溶于醇溶液，因而采用醇提法提取生物碱成分较为普遍。
4）碱化-有机溶剂提取
对于以盐的形式存在的生物碱，预先用碱水处理，可将其转化为游离的形式，再采用有机溶剂进行提取。
5）酸水-碱化-亲脂性溶剂提取
该法在实验室中较为常用，使用于大多数生物碱成分的提取。经过酸水处理，将植物中的生物碱成分都转化为盐的形式，经酸水提出后，再进行碱化，将生物碱转化为游离的形式，最终采用亲脂性溶剂，将总碱部位提出。如蜡梅中生物碱的提取，先采用甲醇对药材浸提4次，获得的浸提物经10%的乙酸溶液溶解，通过乙酸乙酯萃取多次，获得的水相部位经Na2cCO3处理（pH=10），再采用氯仿萃取方法，最终获得总碱成分叫[28]
1.5.2.2 单体生物碱的分离和结构解析
总生物碱的进一步分离纯化，一直是天然产物化学中的一个难点。目前实验室中多采用色谱分离法，包括采用硅胶吸附剂、氧化铝分离材料、反相材料或葡聚糖凝胶等，半制备的HPLC也越来越普及，适用于碱性物质分离的色谱柱也被大量研制出来。
蜡梅属植物中富含生物碱类化学成分，目前已从其他蜡梅属植物中获得的生物碱单
体化合物有（+）-calycanthine、（一）-calycanthidine、（一）-chimonanthine、（一）-chimonanthidine、（一）-fblicanthine、（+）-calycanthidine、（+）-chimonanthine、（+）-fblicanthine、chimonamidine>CPC-1、CPC-2、meso-chimonanthine、tryptamine、Na，Nb-dimethyitryptamine、3-methy-Icarboxymethyl-indole-l-N-β-D-glucopyranoxide[52]。本项目组对柳叶蜡梅的生物碱类化学成分进行细致的研究，共发现8个生物碱单体化合物salicifoxazineA、salicifoxazineB、（一）-chimonanthine、meso-chimonanthine、（—）-fblicanthine、（+）-caIycanthine、（一）-iso-calycanthine和（3aR，3'aR，8-8a，8′-8′a）-tetradehydroisocalycanthine，其中salicifoxazineA和salicifoxazineB是一类具有新颖的氮氧结构片段的全新生物碱（图1-8）[31]。
1）化合物（一）-chimonanthidine的结构鉴定
（一）-chimonanthidine具有二聚吡咯并口吲哚结构，广泛分布于蜡梅属的植物中。（一）-chimonanthidine的结构鉴定过程如下：
无定形粉末；[a]20-285°（c0.05，EtOH）；HR-FABMSm/z361.2392[M+H]+，确定分子式为C23H28N4该分子式中包含12个不饱和度。1H4-NMR图谱中，3个甲基质δ2.36、2.84、2.98分别连接于氮原子上，结合13C-NMR图谱信息，该生物碱与已知生物碱chimonanthine、folicanthine、calycanthidine等具有相同的二聚吡咯并口吲哚型骨架。（一）-chimonanthidine的结构进一步通过二维以及合成的方法确定。（一）-chimonanthidine的绝对构型进一步通过与己知化合物（一）-fblicanthine的圆二色谱（CD）对比确定（图1-9）。
（一）-chimonanthidine1H-NMRCCDCh，600MHz）:2.03～2.07QH，m，H-3，3'），2.24～2.3I（1H，m，H-3'），2.36（3H，s，M-C%），2.44-2.51（3H，m，H-2，3，2'），2.61～2.64（1H，m，H-2），2.84（3H，s，N8′-CH3）2.94～2.97（1H，m，H-2'），2.98（3H，s，M-CH3），4.18（1H，br-s，H-8a），4.58（1H，br-s，H-8'a），6.24（1H，d，J=8.1Hz，H-7'），6.34（1H，d，J=7.8Hz，H-7），6.52（1H，dd，J=7.4Hz，7.4Hz，H-5'），6.56（1H，dd，J=7.6Hz，7.6Hz，H-5），7.00～7.06（4H，m，H-4，6，4'，6'）；i3c-NMR（CDCh，150MHz）:31.1（%'（此），35.0（C-3），35.3（N8-CH3），38.2（C-3'），38.3（N1-CH3），45.6（C-2'），53.0（C-2），62.4（C-3a，3'a），87.2（C-8'a），92.5（C-8a），104.7（C-7，），106.2（C-7），106.2（C-5'），116.9（C-5），124.3（C-4'），124.4（C-4），128.4（06，6'），131.8（C-3'b），132.6（C-3b），152.5（C-7′a），152.8（C-7a）。
2）化合物salicifoxazineA和salicifoxazineB的结构鉴定
SalicifoxazineA为淡黄色油状物，HR-ESIMSm/z363.2176[M+H]+，确定分子式为C22H26N4O。，H-NMR和13C-NMR谱中（表1-11）包含了两套相似的信号，意味着该生物碱可能为二聚化合物。在1H-NMR谱中显示以下官能团的信号：两个单峰连氮甲基质子（δ2.27，2.41；N1-Me，N，-Me）；四个亚甲基质子（δ2.44，m，H2-2；δ2.63，ddd，Ha-3；δ1.71，dt，J=11.8Hz，4.9Hz，Hb-3；δ2.66，ddd，overlapped，Ha-2'；62.33，td，J=11.3Hz，3.5Hz，Hb-2；δ2.45，m，Ha-3；δ2.02，dddJ=13.3Hz，3.5Hz，2.2Hz，Hb-3′）；两个连着杂原子的次甲基质子（δ4.47，brs，H-8a；δ5.11，brs，H-8a′）；两对AA′BB′系统的芳香氢原子信号（δ7.16，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4；δ6.74，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5；δ7.07，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6；δ6.61，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7和δ7.21，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4'；δ6.86，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5'；57.17，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6'；56.71，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7′）。与之相对应的碳谱显示了22个碳信号：两个连氮甲基（δ37.2和46.3）；四个亚甲基（δ52.9和34.3；δ53.8和27.3）；两个季碳信号（δ64.1和50.9）；链各个连接杂原子的次甲基（δ85.2和93.2）；两对邻位取代的苯环（δ125.7，118.6，128.3，109.2，151.1，132.3；δ125.1，118.8，128.5，109.5，151.1，129.4）。此外，紫外吸收光谱中241nm和298nm处的吸收波长表明PhNCN发射官能团的存在。
上述NMR数据与已知化合物（一）-chimonanthine有着高度相似，说明salicifoxazineA也是一个二聚色胺生物碱。与（一）-chimonanthine不同的是，㈠-chimonanthine中N1-Me的化学位移在37.4，而salicifoxazineA的在46.3，（一）-chimonanthine中C-8a，在&85.6，而salicifoxazineA的在&93.2。这两个向低场迁移的信号，说明N1和C-8a′之间插入了一个氧原子，从而形成具有独特的嗪六元环的结构。由此可以推断出salicifoxazineA的平面结构。
止匕外，salicifoxazineA的旋光值为[a]-243.9。（c-0.37，MeOH），该值与已知化合物（一）-chimonanthine[a]20-310°（c0.80，EtOH）和（一）-chimonanthidine[a]20-285°（c0.05，EtOH）相近。进一步测定salicifoxazineA的CD图谱（图1-10），其CD图谱与已知化合物（一）-chimonanthidine（图1-9）相似。由此可以推断出salicifoxazineA的结构如图1-8所示。
SalicifbxazineB的HR-ES1MSm/z385.1995[M+Na]+，确定分子式为C22H26N4O，且其NMR图谱与salicifbxazineA的高度相似，可知salicifoxazineB的平面结构与salicifoxazineA相同。与salicifoxazineA不同的是，salicifoxazineB的旋光值为[a]20-2.2°，该值与meso-chimonanthine的[a]20相近。此外，salicifbxazineB的CD图谱并未见明显的Cotton效应，且手性柱分析该化合物为手性纯化合物，说明salicifoxazineB为内消旋化合物。
