宁德市图书馆 内容
1.5.1 柳叶蜡梅中非生物碱成分的提取与分离
1.5.1.1 植物来源
柳叶蜡梅叶于2011年7月由浙江省松阳县碧岚茶厂雷国兴农技师采于浙江省丽水市柳叶蜡梅GAP种植基地，经丽水市食品药品检验所李建良副主任中药师鉴定为柳叶蜡梅的干燥叶。
1.5.1.2 提取分离流程
柳叶蜡梅非挥发性成分的提取分离过程实验流程图见图1-7。
1.5.1.3 化合物的结构鉴定
1）化合物l（9-epi-blumenolC）的结构鉴定
化合物1为无色油状物；[a]20D0.06，CHCl₃）；ESI-MSm/z211[M+H]+。HNMR（CDC13，表1-3）显示含4个甲基质子J2.02、1.24、1.10、1.04（化学位移单位为ppm，下同，为简便起见，此后略去单位）和1个烯质子（55.85（1H，s）。13c-NMR（CDC13，表1-3）显示含13个碳原子，包括1个羰基碳原子0198.0）、2个烯碳原子（8164.1，123.7），HSQC（氢的异核单量子相干谱）显示还存在1个季碳原子、2个叔碳原子，其中1个与氧相连的碳原子（66.6），以及3个仲碳原子，结合MS图谱，推得1的分子式为G13H22O2，包含3个不饱和度。HMBC（氢的异核多量子相干谱）显示羰基碳（198.0）分别与51.10、1.04的甲基质子和62.42（lH，d，J=17.0Hz）、2.06（lH，d，J=17.0Hz）的亚甲基质子相关，且仲碳（45.6）与烯质子（5.85）相关，叔碳（49.5）与2.02（3H，d，J=1.2Hz）的双键取代甲基质子和2.42、2.06的亚甲基质子相关，由此推测该化合物为一个具有a，β-不饱和羰基的六元环。1H-1HCOSY（同核化学位移相关谱）显示C-6位（1.90）与仲碳的1.92、1.45质子相关，结合末端氢1.24（3H，d，J=6.1Hz）可推测出与末端氢相连的是被羟基取代的次甲基，HMBC还显示该次甲基（66.6）与1.55（2H，m）和1.92（1H，m）、1.45（lH，m）质子相关，可推测出该化合物6位取代边链为3-羟基丁烷。经理化数据及波谱数据比对[43]，鉴定为byzantionosideB的水解产物9-epi-blumenolC，为一新的天然产物。
2）化合物2（blumenolC）的结构鉴定
化合物2为无色油状物；[a]20+34°（c0.35，CHCh），ESI-MSm/z211[M+H]。化合物2与化合物1具有相同的分子量，二者的1H-NMR（CDC13，表1-4）和13C-NMR（CDCl3，表1-4）的数据相似，考虑为化合物1的同分异构体。1H-NMR显示含4个甲基质子2.00（3H，d，J=1.2Hz），1.20（3H，d，J=6.1Hz），1.06（3H，s），1.01（3H，s）和1个烯质子5.82（1H，s）。13C-NMR显示含13个碳原子，包括1个羰基碳原子（199.5），2个烯碳原子（165.6，125.1），1个与氧相连的碳原子（68.1）。与已知化合物对照[44]波谱数据基本一致，鉴定为blumenolC.
3）化合物3[（+）-去氢催吐萝芙叶醇]的结构鉴定
化合物3为无色油状物；[a]巧+178°0.96，CHC13）；ESI-MSm/z223[M+H]+。
1H-NMR（CDC13，表1-5）谱显示含52.30（3H，s）、1.88（3H，d，J=1.4Hz）、1.09（3H，s）和1.01（3H，s）4个甲基质子，6.83（lH，d，J=16.0Hz）、6.46（1H，d，J=16.0Hz）为一对双键上的E式烯质子；32.37（1H，d，J=16.0Hz）、2.49（1H，d，J=16.0Hz）提示为一个亚甲基。13C-NMR（CDC13，表1-5）显示化合物3含13个碳原子，与化合物1相比，多了1个羰基和2个烯碳信号，相应高场区少了3个碳信号。进一步与化合物1的HSQC谱比较，发现化合物3缺少叔碳原子，多了1个季碳原子。1H-1HCOSY显示烯质子5.94（lH，s）与1.88（3H，d，J=1.4Hz）和2.37（1H，d，J=16.0Hz）相关，推测存在β位被甲基取代的a，β不饱和羰基片段。与己知化合物对照[45]，波谱数据基本一致，鉴定为（+）-去氢催吐萝芙叶醇[（+）-dehydrovomifoliol]。
4）化合物4[（+）-催吐萝芙叶醇]的结构鉴定
化合物4为无色半固体；[a]20+160°（c1.02，CHC13）；ESI-MSm/z225[M+H]+。13C-NMR（CDC13，表1-6）显示化合物4含13个碳原子，与化合物3相比少了1个羰基，多了1个与O相连的碳原子（67.8），分子量对应增加了2个质量数，提示化合物4可能为化合物3的羰基还原产物。1H-NMR（CDCl3b，表1-6）显示含4个甲基质子51.82（3H，d，J=l」Hz）、l.I8（3H，d，J=6.3Hz）、0.97（3H，s）和0.93（3H，s）；另5.67（1H，d，J=16.0Hz）、5.72（lH，dd，J=16.0Hz，5.0Hz）推测为E式双键的一对氢质子，且55.72烯质子的另一端连接一个次甲基；2.35（lH，d，J=17.0Hz）、2.12（1H，d，J=17.0Hz）提示为一个亚甲基。与已知化合物对照[46]，波谱数据基本一致，鉴定为（+）-催吐萝芙叶醇[（+）-vomifbliol]。
5）化合物5（robinlin）的结构鉴定
化合物5为无色半固体；[a]+77°（c1.01，CHCl3）；ESI-MSm/z199[M+H]+。1H-NMR（CDC13，表1-7）显示含3个甲基质子J1.82（3H，s）、1.22（3H，s）和1.16（3H，s）»13C-NMR（CDC13，表1-7）显示含11个碳原子，包括1个城基碳原子（200.1），2个烯碳原子（161.6，129.4），2个与O相连的碳原子（69.2，60.7），1H-NMR未见烯质子信号，可推测化合物含有两个被完全取代的烯碳原子。1H-1HCOSY谱显示54.25（1H，dd，J=14.0Hz，6.0Hz）、1.70（lH，t，J=14.0Hz）、2.08（1H，dd，J=14.0Hz，6.0Hz）相互关联；1.22（3H，brs）、1.16（3H，brs）相关，推测为连接于季碳上的两个甲基；3.75（1H，m）、3.66（lH，m）、2.60（lH，m）和2.49（lH，m）4个质子也相互关联。与已知化合物对照[47]，波谱数据基本一致，鉴定为robinlin。
6）化合物6（黑麦交酯）的结构鉴定
化合物6为无色半固体；[a]-54°（c0.17，CHC13）；ESI-MSm/z197[M+H]+.H-NMR（CDC13，表1-8）谱显示含3个甲基质子1.78（3H，s）、1.47（3H，s）和127（3H，s），1个烯质子5.69（1H，s）。13C-NMR（CDC13，表1-8）谱显示含11个碳原子，包括一个酰基碳原子3171.9），2个烯碳原子0182.4，112.9），2个与O相连的碳原子086.7，66.9）。NOESY（核极化Overhauser效应光谱）显示4位CH2中2个质子1.79、2.47分别与4.33的质子和1.78的甲基质子相关，判断3位羟基与5位角甲基为同侧，结合旋光数据，与已知化合物对照।明[48]，波谱数据基本一致，鉴定为（一）-黑麦交酯[（一）-loliolide]。
7）化合物7（异嗪皮啶）的结构鉴定
化合物7为淡黄色针晶（CH3OH）；mp145～146℃；EI-MSm/z222[M]+。1H-NMR图谱[（CD3）2CO，表1-9]显示化学位移在7.84（1H，d，J=9.5Hz）、6.20（1H，d，J=9.5Hz）的两个氢为一对顺式双键上的氢，6.97（1H，s）为芳香质子，另外还含2个甲氧基质子（3.93，3.95）。紫外365nm下显示黄绿色荧光，推测化合物7为香豆素。NOESY显示3.93的甲氧基质子与6.97的芳香质子相关联，而与3.95的甲氧基质子没有相关信号，故推测2个甲氧基分别取代在6位和8位。与已知化合物对照[24]，波谱数据基本一致，鉴定为异嗪皮啶（isofraxidin）。
8）化合物8（东莨菪亭）的结构鉴定
化合物8为淡黄色针晶（CH3OH）；mp210～211℃；EI-MSm/192[M]+；紫外365nm下显示黄绿色荧光。1H-NMR[（CD3）2CO，表1-9]显示δ7.85（1H，d，J=9.5Hz）、6.18（1H，d，J=9.5Hz）为一对顺式双键质子，δ56.8O（1H，s）、7.20（1H，s）为2个孤立的芳香质子，δ3.90为1个甲氧基质子，推测化合物8为香豆素。与已知化合物对照[24]，波谱数据基本一致，鉴定为东莨菪亭（scopoletin）。
9）化合物9（6，7-二甲氧基香豆素）的结构鉴定
化合物9为无色针晶（CH3OH）；mp141～142℃；ESI-MSm/z207[M+H]+，紫外365nm下显示蓝紫色荧光。1H-NMR（CDC13，表1-9）谱显示δ7.62（1H，d，J=9.5Hz）、6.28（1H，d，J=9.5Hz）为一对顺式双键质子，另外还含2个甲氧基质子（δ3.91，3.94），δ6.85（lH，s）、6.82（1H，s）为2个孤立的芳香质子，推测化合物9为香豆素。与已知化合物对照[24]，波谱数据基本二致，鉴定为6，7-二甲氧基香豆素（6，7-dimethoxycoumarin）。
10）化合物10（6，7，8-三甲氧基香豆素）的结构鉴定
化合物10为无色针晶（CH3OH）；mp83～84℃；ESI-MSm/z237[M+H]+；紫外365nm下显示黄绿色荧光。1H-NMR（CDCl3，表1-9）显示δ7.62（1H，d，J=9.5Hz）、6.36（lH，d，J=9.5Hz）为一对顺式双键质子，推测化合物10为香豆素。δ6.67（1H，s）为苯环上唯一质子信号，另外还显示3个甲氧基质子（δ3.90，4.00，4.04），4位δ7.62说明未受5位迫位效应（theperieffect）的影响，提示5位未被取代。与已知化合物对照明，波谱数据基本一致，鉴定为6，7，8-三甲氧基香豆素（6，7，8-trimethoxycoumarin）<，
11）化合物11（β-谷甾酮）的结构鉴定
化合物11为无色针晶（CH3OH）；mp84～
85℃；[a]22；+66°（c0.51，CHC13）；ESI-MSm/z413[M+H]+。1H-NMR（CDC13，600MHz）显示含6个甲基质子δ1.18（3H，s），0.92（3H，d，J=8.0Hz）、0.85（3H，s）、0.82（3H，s）、0.81（3H，s）、O.71（3H，s），1个烯质子δ5.72（1H，s）。13C-NMR（CDC13，150MHz）显示含29个碳原子，包括1个羰基碳原子（δ199.6），2个烯碳原子（δ171.7，123.8）。与已知化合物对照[49]，波谱数据基本一致，鉴定为β3-谷甾酮（β-sitostenone）。
12）化合物12（β-谷甾醇）的结构鉴定
化合物12为白色针晶（CH3OH）；mp135～136℃；[a]23-36°（c0.52，CHCI3）；ESI-MSm/z415[M+H]+。1H-NMR（CDCL3，400MHz）显示含6个甲基质子δ1.01（3H，s），0.92（3H，d，J=6.5Hz）、0.85（3H，t，J=8.4Hz）、0.84（3H，d，J=7.6Hz）、0.81（3H；d，J=7.6Hz）、0.68（3H，s），1个烯质子δ5.35（1H，brd，J=5.2Hz）.13C-NMR（CDCL3，100MHz）显示含29个碳原子。与已知化合物对照[50]，波谱数据基本一致，鉴定为β-谷甾醇（β-sitosterol）。
13）化合物13[2，6，2，6'-tetramethoxy-4，4'-bis（2，3-epoxy-l-hydroxylpropyl）biphenyl]的结构鉴定
化合物13为无色方晶（CH3OH）；mp171～172℃；[a]22-14°（c0.55，CHCl3）；ESI-MSm/z419[M+H]+。13C-NMR（CDCI3，表1-10）显示8个碳原子信号，包括3个与O原子相连的碳原子（δ86.1，71.8，54.3），结合ESI-MS给出的准分子离子峰为419，推测化合物13为轴对称型化合物。1H-NMR（CDCl3，表1-10）显示δ6.57（4H.s）为两个对称取代苯环上的4个质子，J3.91（12H，s）为两个苯环上的4个甲氧基质子，35.54（2H，s）为羟基上的活泼氢，δ4.74（2H，d，J=4.0Hz）、4.26（2H，m）、3.91（2H，m）、3.10（2H，m）都是与O相连的碳原子上的质子信号。与已知化合物对照[51]，波谱数据基本一致，故鉴定其平面结构为2，6，2，6-tetramethoxy-4，4′-bis（2，3-epoxy-1-hydroxylpropyl）biphenyl。由于其旋光为左旋，与已知化合物的右旋不同，所以该化合物的绝对构型有待进一步的实验确认。
1.5.2 柳叶蜡梅中生物碱成分的提取和分离
在蜡梅属其他不少植物中，文献报道了蜡梅碱、山蜡梅碱等生物碱类化合物的发现。由于生物碱具有与其他非挥发性成分不同的性质，它具有弱碱性、易被常规分离材料吸附，故生物碱成分的分离采用特殊的分离材料和分离流程。
1.5.2.1 总生物碱的提取
总生物碱的提取常用方法有溶剂法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、渗漉薄膜蒸发连续提取法和超临界流体萃取法。对于已报道的蜡梅属总生物碱部位的提取主要采用的是溶剂法。溶剂法主要包括水直接提取、酸水-有机溶剂提取、醇提取、碱化-有机溶剂提取以及以上相结合的方法。
1）水直接提取
直接以水作为提取溶剂，操作简单，成本较低，水提液经喷雾干燥得到总碱提取物。
但是该法在提取生物碱成分时，也会带入大量其他非生物碱的水溶性物质，为后面的生物碱的进一步分离纯化带来极大的困难。不适用于含大量淀粉和水溶性蛋白的植物。
2）酸水-有机溶剂提取
具有碱性的生物碱在植物体中多以盐的形式存在，而弱碱性或呈中性的生物碱多以不稳定的盐以及游离碱的形式存在。故常用弱酸为溶剂将生物碱成分转化为盐的形式，采用酸水提取。
3）醇提取
游离形式存在的生物碱或以盐形式存在的生物碱一般都能溶于醇溶液，因而采用醇提法提取生物碱成分较为普遍。
4）碱化-有机溶剂提取
对于以盐的形式存在的生物碱，预先用碱水处理，可将其转化为游离的形式，再采用有机溶剂进行提取。
5）酸水-碱化-亲脂性溶剂提取
该法在实验室中较为常用，使用于大多数生物碱成分的提取。经过酸水处理，将植物中的生物碱成分都转化为盐的形式，经酸水提出后，再进行碱化，将生物碱转化为游离的形式，最终采用亲脂性溶剂，将总碱部位提出。如蜡梅中生物碱的提取，先采用甲醇对药材浸提4次，获得的浸提物经10%的乙酸溶液溶解，通过乙酸乙酯萃取多次，获得的水相部位经Na2cCO3处理（pH=10），再采用氯仿萃取方法，最终获得总碱成分叫[28]
1.5.2.2 单体生物碱的分离和结构解析
总生物碱的进一步分离纯化，一直是天然产物化学中的一个难点。目前实验室中多采用色谱分离法，包括采用硅胶吸附剂、氧化铝分离材料、反相材料或葡聚糖凝胶等，半制备的HPLC也越来越普及，适用于碱性物质分离的色谱柱也被大量研制出来。
蜡梅属植物中富含生物碱类化学成分，目前已从其他蜡梅属植物中获得的生物碱单
体化合物有（+）-calycanthine、（一）-calycanthidine、（一）-chimonanthine、（一）-chimonanthidine、（一）-fblicanthine、（+）-calycanthidine、（+）-chimonanthine、（+）-fblicanthine、chimonamidine>CPC-1、CPC-2、meso-chimonanthine、tryptamine、Na，Nb-dimethyitryptamine、3-methy-Icarboxymethyl-indole-l-N-β-D-glucopyranoxide[52]。本项目组对柳叶蜡梅的生物碱类化学成分进行细致的研究，共发现8个生物碱单体化合物salicifoxazineA、salicifoxazineB、（一）-chimonanthine、meso-chimonanthine、（—）-fblicanthine、（+）-caIycanthine、（一）-iso-calycanthine和（3aR，3'aR，8-8a，8′-8′a）-tetradehydroisocalycanthine，其中salicifoxazineA和salicifoxazineB是一类具有新颖的氮氧结构片段的全新生物碱（图1-8）[31]。
1）化合物（一）-chimonanthidine的结构鉴定
（一）-chimonanthidine具有二聚吡咯并口吲哚结构，广泛分布于蜡梅属的植物中。（一）-chimonanthidine的结构鉴定过程如下：
无定形粉末；[a]20-285°（c0.05，EtOH）；HR-FABMSm/z361.2392[M+H]+，确定分子式为C23H28N4该分子式中包含12个不饱和度。1H4-NMR图谱中，3个甲基质δ2.36、2.84、2.98分别连接于氮原子上，结合13C-NMR图谱信息，该生物碱与已知生物碱chimonanthine、folicanthine、calycanthidine等具有相同的二聚吡咯并口吲哚型骨架。（一）-chimonanthidine的结构进一步通过二维以及合成的方法确定。（一）-chimonanthidine的绝对构型进一步通过与己知化合物（一）-fblicanthine的圆二色谱（CD）对比确定（图1-9）。
（一）-chimonanthidine1H-NMRCCDCh，600MHz）:2.03～2.07QH，m，H-3，3'），2.24～2.3I（1H，m，H-3'），2.36（3H，s，M-C%），2.44-2.51（3H，m，H-2，3，2'），2.61～2.64（1H，m，H-2），2.84（3H，s，N8′-CH3）2.94～2.97（1H，m，H-2'），2.98（3H，s，M-CH3），4.18（1H，br-s，H-8a），4.58（1H，br-s，H-8'a），6.24（1H，d，J=8.1Hz，H-7'），6.34（1H，d，J=7.8Hz，H-7），6.52（1H，dd，J=7.4Hz，7.4Hz，H-5'），6.56（1H，dd，J=7.6Hz，7.6Hz，H-5），7.00～7.06（4H，m，H-4，6，4'，6'）；i3c-NMR（CDCh，150MHz）:31.1（%'（此），35.0（C-3），35.3（N8-CH3），38.2（C-3'），38.3（N1-CH3），45.6（C-2'），53.0（C-2），62.4（C-3a，3'a），87.2（C-8'a），92.5（C-8a），104.7（C-7，），106.2（C-7），106.2（C-5'），116.9（C-5），124.3（C-4'），124.4（C-4），128.4（06，6'），131.8（C-3'b），132.6（C-3b），152.5（C-7′a），152.8（C-7a）。
2）化合物salicifoxazineA和salicifoxazineB的结构鉴定
SalicifoxazineA为淡黄色油状物，HR-ESIMSm/z363.2176[M+H]+，确定分子式为C22H26N4O。，H-NMR和13C-NMR谱中（表1-11）包含了两套相似的信号，意味着该生物碱可能为二聚化合物。在1H-NMR谱中显示以下官能团的信号：两个单峰连氮甲基质子（δ2.27，2.41；N1-Me，N，-Me）；四个亚甲基质子（δ2.44，m，H2-2；δ2.63，ddd，Ha-3；δ1.71，dt，J=11.8Hz，4.9Hz，Hb-3；δ2.66，ddd，overlapped，Ha-2'；62.33，td，J=11.3Hz，3.5Hz，Hb-2；δ2.45，m，Ha-3；δ2.02，dddJ=13.3Hz，3.5Hz，2.2Hz，Hb-3′）；两个连着杂原子的次甲基质子（δ4.47，brs，H-8a；δ5.11，brs，H-8a′）；两对AA′BB′系统的芳香氢原子信号（δ7.16，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4；δ6.74，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5；δ7.07，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6；δ6.61，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7和δ7.21，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4'；δ6.86，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5'；57.17，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6'；56.71，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7′）。与之相对应的碳谱显示了22个碳信号：两个连氮甲基（δ37.2和46.3）；四个亚甲基（δ52.9和34.3；δ53.8和27.3）；两个季碳信号（δ64.1和50.9）；链各个连接杂原子的次甲基（δ85.2和93.2）；两对邻位取代的苯环（δ125.7，118.6，128.3，109.2，151.1，132.3；δ125.1，118.8，128.5，109.5，151.1，129.4）。此外，紫外吸收光谱中241nm和298nm处的吸收波长表明PhNCN发射官能团的存在。
上述NMR数据与已知化合物（一）-chimonanthine有着高度相似，说明salicifoxazineA也是一个二聚色胺生物碱。与（一）-chimonanthine不同的是，㈠-chimonanthine中N1-Me的化学位移在37.4，而salicifoxazineA的在46.3，（一）-chimonanthine中C-8a，在&85.6，而salicifoxazineA的在&93.2。这两个向低场迁移的信号，说明N1和C-8a′之间插入了一个氧原子，从而形成具有独特的嗪六元环的结构。由此可以推断出salicifoxazineA的平面结构。
止匕外，salicifoxazineA的旋光值为[a]-243.9。（c-0.37，MeOH），该值与已知化合物（一）-chimonanthine[a]20-310°（c0.80，EtOH）和（一）-chimonanthidine[a]20-285°（c0.05，EtOH）相近。进一步测定salicifoxazineA的CD图谱（图1-10），其CD图谱与已知化合物（一）-chimonanthidine（图1-9）相似。由此可以推断出salicifoxazineA的结构如图1-8所示。
SalicifbxazineB的HR-ES1MSm/z385.1995[M+Na]+，确定分子式为C22H26N4O，且其NMR图谱与salicifbxazineA的高度相似，可知salicifoxazineB的平面结构与salicifoxazineA相同。与salicifoxazineA不同的是，salicifoxazineB的旋光值为[a]20-2.2°，该值与meso-chimonanthine的[a]20相近。此外，salicifbxazineB的CD图谱并未见明显的Cotton效应，且手性柱分析该化合物为手性纯化合物，说明salicifoxazineB为内消旋化
1.5.1.1 植物来源
柳叶蜡梅叶于2011年7月由浙江省松阳县碧岚茶厂雷国兴农技师采于浙江省丽水市柳叶蜡梅GAP种植基地，经丽水市食品药品检验所李建良副主任中药师鉴定为柳叶蜡梅的干燥叶。
1.5.1.2 提取分离流程
柳叶蜡梅非挥发性成分的提取分离过程实验流程图见图1-7。
1.5.1.3 化合物的结构鉴定
1）化合物l（9-epi-blumenolC）的结构鉴定
化合物1为无色油状物；[a]20D0.06，CHCl₃）；ESI-MSm/z211[M+H]+。HNMR（CDC13，表1-3）显示含4个甲基质子J2.02、1.24、1.10、1.04（化学位移单位为ppm，下同，为简便起见，此后略去单位）和1个烯质子（55.85（1H，s）。13c-NMR（CDC13，表1-3）显示含13个碳原子，包括1个羰基碳原子0198.0）、2个烯碳原子（8164.1，123.7），HSQC（氢的异核单量子相干谱）显示还存在1个季碳原子、2个叔碳原子，其中1个与氧相连的碳原子（66.6），以及3个仲碳原子，结合MS图谱，推得1的分子式为G13H22O2，包含3个不饱和度。HMBC（氢的异核多量子相干谱）显示羰基碳（198.0）分别与51.10、1.04的甲基质子和62.42（lH，d，J=17.0Hz）、2.06（lH，d，J=17.0Hz）的亚甲基质子相关，且仲碳（45.6）与烯质子（5.85）相关，叔碳（49.5）与2.02（3H，d，J=1.2Hz）的双键取代甲基质子和2.42、2.06的亚甲基质子相关，由此推测该化合物为一个具有a，β-不饱和羰基的六元环。1H-1HCOSY（同核化学位移相关谱）显示C-6位（1.90）与仲碳的1.92、1.45质子相关，结合末端氢1.24（3H，d，J=6.1Hz）可推测出与末端氢相连的是被羟基取代的次甲基，HMBC还显示该次甲基（66.6）与1.55（2H，m）和1.92（1H，m）、1.45（lH，m）质子相关，可推测出该化合物6位取代边链为3-羟基丁烷。经理化数据及波谱数据比对[43]，鉴定为byzantionosideB的水解产物9-epi-blumenolC，为一新的天然产物。
2）化合物2（blumenolC）的结构鉴定
化合物2为无色油状物；[a]20+34°（c0.35，CHCh），ESI-MSm/z211[M+H]。化合物2与化合物1具有相同的分子量，二者的1H-NMR（CDC13，表1-4）和13C-NMR（CDCl3，表1-4）的数据相似，考虑为化合物1的同分异构体。1H-NMR显示含4个甲基质子2.00（3H，d，J=1.2Hz），1.20（3H，d，J=6.1Hz），1.06（3H，s），1.01（3H，s）和1个烯质子5.82（1H，s）。13C-NMR显示含13个碳原子，包括1个羰基碳原子（199.5），2个烯碳原子（165.6，125.1），1个与氧相连的碳原子（68.1）。与已知化合物对照[44]波谱数据基本一致，鉴定为blumenolC.
3）化合物3[（+）-去氢催吐萝芙叶醇]的结构鉴定
化合物3为无色油状物；[a]巧+178°0.96，CHC13）；ESI-MSm/z223[M+H]+。
1H-NMR（CDC13，表1-5）谱显示含52.30（3H，s）、1.88（3H，d，J=1.4Hz）、1.09（3H，s）和1.01（3H，s）4个甲基质子，6.83（lH，d，J=16.0Hz）、6.46（1H，d，J=16.0Hz）为一对双键上的E式烯质子；32.37（1H，d，J=16.0Hz）、2.49（1H，d，J=16.0Hz）提示为一个亚甲基。13C-NMR（CDC13，表1-5）显示化合物3含13个碳原子，与化合物1相比，多了1个羰基和2个烯碳信号，相应高场区少了3个碳信号。进一步与化合物1的HSQC谱比较，发现化合物3缺少叔碳原子，多了1个季碳原子。1H-1HCOSY显示烯质子5.94（lH，s）与1.88（3H，d，J=1.4Hz）和2.37（1H，d，J=16.0Hz）相关，推测存在β位被甲基取代的a，β不饱和羰基片段。与己知化合物对照[45]，波谱数据基本一致，鉴定为（+）-去氢催吐萝芙叶醇[（+）-dehydrovomifoliol]。
4）化合物4[（+）-催吐萝芙叶醇]的结构鉴定
化合物4为无色半固体；[a]20+160°（c1.02，CHC13）；ESI-MSm/z225[M+H]+。13C-NMR（CDC13，表1-6）显示化合物4含13个碳原子，与化合物3相比少了1个羰基，多了1个与O相连的碳原子（67.8），分子量对应增加了2个质量数，提示化合物4可能为化合物3的羰基还原产物。1H-NMR（CDCl3b，表1-6）显示含4个甲基质子51.82（3H，d，J=l」Hz）、l.I8（3H，d，J=6.3Hz）、0.97（3H，s）和0.93（3H，s）；另5.67（1H，d，J=16.0Hz）、5.72（lH，dd，J=16.0Hz，5.0Hz）推测为E式双键的一对氢质子，且55.72烯质子的另一端连接一个次甲基；2.35（lH，d，J=17.0Hz）、2.12（1H，d，J=17.0Hz）提示为一个亚甲基。与已知化合物对照[46]，波谱数据基本一致，鉴定为（+）-催吐萝芙叶醇[（+）-vomifbliol]。
5）化合物5（robinlin）的结构鉴定
化合物5为无色半固体；[a]+77°（c1.01，CHCl3）；ESI-MSm/z199[M+H]+。1H-NMR（CDC13，表1-7）显示含3个甲基质子J1.82（3H，s）、1.22（3H，s）和1.16（3H，s）»13C-NMR（CDC13，表1-7）显示含11个碳原子，包括1个城基碳原子（200.1），2个烯碳原子（161.6，129.4），2个与O相连的碳原子（69.2，60.7），1H-NMR未见烯质子信号，可推测化合物含有两个被完全取代的烯碳原子。1H-1HCOSY谱显示54.25（1H，dd，J=14.0Hz，6.0Hz）、1.70（lH，t，J=14.0Hz）、2.08（1H，dd，J=14.0Hz，6.0Hz）相互关联；1.22（3H，brs）、1.16（3H，brs）相关，推测为连接于季碳上的两个甲基；3.75（1H，m）、3.66（lH，m）、2.60（lH，m）和2.49（lH，m）4个质子也相互关联。与已知化合物对照[47]，波谱数据基本一致，鉴定为robinlin。
6）化合物6（黑麦交酯）的结构鉴定
化合物6为无色半固体；[a]-54°（c0.17，CHC13）；ESI-MSm/z197[M+H]+.H-NMR（CDC13，表1-8）谱显示含3个甲基质子1.78（3H，s）、1.47（3H，s）和127（3H，s），1个烯质子5.69（1H，s）。13C-NMR（CDC13，表1-8）谱显示含11个碳原子，包括一个酰基碳原子3171.9），2个烯碳原子0182.4，112.9），2个与O相连的碳原子086.7，66.9）。NOESY（核极化Overhauser效应光谱）显示4位CH2中2个质子1.79、2.47分别与4.33的质子和1.78的甲基质子相关，判断3位羟基与5位角甲基为同侧，结合旋光数据，与已知化合物对照।明[48]，波谱数据基本一致，鉴定为（一）-黑麦交酯[（一）-loliolide]。
7）化合物7（异嗪皮啶）的结构鉴定
化合物7为淡黄色针晶（CH3OH）；mp145～146℃；EI-MSm/z222[M]+。1H-NMR图谱[（CD3）2CO，表1-9]显示化学位移在7.84（1H，d，J=9.5Hz）、6.20（1H，d，J=9.5Hz）的两个氢为一对顺式双键上的氢，6.97（1H，s）为芳香质子，另外还含2个甲氧基质子（3.93，3.95）。紫外365nm下显示黄绿色荧光，推测化合物7为香豆素。NOESY显示3.93的甲氧基质子与6.97的芳香质子相关联，而与3.95的甲氧基质子没有相关信号，故推测2个甲氧基分别取代在6位和8位。与已知化合物对照[24]，波谱数据基本一致，鉴定为异嗪皮啶（isofraxidin）。
8）化合物8（东莨菪亭）的结构鉴定
化合物8为淡黄色针晶（CH3OH）；mp210～211℃；EI-MSm/192[M]+；紫外365nm下显示黄绿色荧光。1H-NMR[（CD3）2CO，表1-9]显示δ7.85（1H，d，J=9.5Hz）、6.18（1H，d，J=9.5Hz）为一对顺式双键质子，δ56.8O（1H，s）、7.20（1H，s）为2个孤立的芳香质子，δ3.90为1个甲氧基质子，推测化合物8为香豆素。与已知化合物对照[24]，波谱数据基本一致，鉴定为东莨菪亭（scopoletin）。
9）化合物9（6，7-二甲氧基香豆素）的结构鉴定
化合物9为无色针晶（CH3OH）；mp141～142℃；ESI-MSm/z207[M+H]+，紫外365nm下显示蓝紫色荧光。1H-NMR（CDC13，表1-9）谱显示δ7.62（1H，d，J=9.5Hz）、6.28（1H，d，J=9.5Hz）为一对顺式双键质子，另外还含2个甲氧基质子（δ3.91，3.94），δ6.85（lH，s）、6.82（1H，s）为2个孤立的芳香质子，推测化合物9为香豆素。与已知化合物对照[24]，波谱数据基本二致，鉴定为6，7-二甲氧基香豆素（6，7-dimethoxycoumarin）。
10）化合物10（6，7，8-三甲氧基香豆素）的结构鉴定
化合物10为无色针晶（CH3OH）；mp83～84℃；ESI-MSm/z237[M+H]+；紫外365nm下显示黄绿色荧光。1H-NMR（CDCl3，表1-9）显示δ7.62（1H，d，J=9.5Hz）、6.36（lH，d，J=9.5Hz）为一对顺式双键质子，推测化合物10为香豆素。δ6.67（1H，s）为苯环上唯一质子信号，另外还显示3个甲氧基质子（δ3.90，4.00，4.04），4位δ7.62说明未受5位迫位效应（theperieffect）的影响，提示5位未被取代。与已知化合物对照明，波谱数据基本一致，鉴定为6，7，8-三甲氧基香豆素（6，7，8-trimethoxycoumarin）<，
11）化合物11（β-谷甾酮）的结构鉴定
化合物11为无色针晶（CH3OH）；mp84～
85℃；[a]22；+66°（c0.51，CHC13）；ESI-MSm/z413[M+H]+。1H-NMR（CDC13，600MHz）显示含6个甲基质子δ1.18（3H，s），0.92（3H，d，J=8.0Hz）、0.85（3H，s）、0.82（3H，s）、0.81（3H，s）、O.71（3H，s），1个烯质子δ5.72（1H，s）。13C-NMR（CDC13，150MHz）显示含29个碳原子，包括1个羰基碳原子（δ199.6），2个烯碳原子（δ171.7，123.8）。与已知化合物对照[49]，波谱数据基本一致，鉴定为β3-谷甾酮（β-sitostenone）。
12）化合物12（β-谷甾醇）的结构鉴定
化合物12为白色针晶（CH3OH）；mp135～136℃；[a]23-36°（c0.52，CHCI3）；ESI-MSm/z415[M+H]+。1H-NMR（CDCL3，400MHz）显示含6个甲基质子δ1.01（3H，s），0.92（3H，d，J=6.5Hz）、0.85（3H，t，J=8.4Hz）、0.84（3H，d，J=7.6Hz）、0.81（3H；d，J=7.6Hz）、0.68（3H，s），1个烯质子δ5.35（1H，brd，J=5.2Hz）.13C-NMR（CDCL3，100MHz）显示含29个碳原子。与已知化合物对照[50]，波谱数据基本一致，鉴定为β-谷甾醇（β-sitosterol）。
13）化合物13[2，6，2，6'-tetramethoxy-4，4'-bis（2，3-epoxy-l-hydroxylpropyl）biphenyl]的结构鉴定
化合物13为无色方晶（CH3OH）；mp171～172℃；[a]22-14°（c0.55，CHCl3）；ESI-MSm/z419[M+H]+。13C-NMR（CDCI3，表1-10）显示8个碳原子信号，包括3个与O原子相连的碳原子（δ86.1，71.8，54.3），结合ESI-MS给出的准分子离子峰为419，推测化合物13为轴对称型化合物。1H-NMR（CDCl3，表1-10）显示δ6.57（4H.s）为两个对称取代苯环上的4个质子，J3.91（12H，s）为两个苯环上的4个甲氧基质子，35.54（2H，s）为羟基上的活泼氢，δ4.74（2H，d，J=4.0Hz）、4.26（2H，m）、3.91（2H，m）、3.10（2H，m）都是与O相连的碳原子上的质子信号。与已知化合物对照[51]，波谱数据基本一致，故鉴定其平面结构为2，6，2，6-tetramethoxy-4，4′-bis（2，3-epoxy-1-hydroxylpropyl）biphenyl。由于其旋光为左旋，与已知化合物的右旋不同，所以该化合物的绝对构型有待进一步的实验确认。
1.5.2 柳叶蜡梅中生物碱成分的提取和分离
在蜡梅属其他不少植物中，文献报道了蜡梅碱、山蜡梅碱等生物碱类化合物的发现。由于生物碱具有与其他非挥发性成分不同的性质，它具有弱碱性、易被常规分离材料吸附，故生物碱成分的分离采用特殊的分离材料和分离流程。
1.5.2.1 总生物碱的提取
总生物碱的提取常用方法有溶剂法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、渗漉薄膜蒸发连续提取法和超临界流体萃取法。对于已报道的蜡梅属总生物碱部位的提取主要采用的是溶剂法。溶剂法主要包括水直接提取、酸水-有机溶剂提取、醇提取、碱化-有机溶剂提取以及以上相结合的方法。
1）水直接提取
直接以水作为提取溶剂，操作简单，成本较低，水提液经喷雾干燥得到总碱提取物。
但是该法在提取生物碱成分时，也会带入大量其他非生物碱的水溶性物质，为后面的生物碱的进一步分离纯化带来极大的困难。不适用于含大量淀粉和水溶性蛋白的植物。
2）酸水-有机溶剂提取
具有碱性的生物碱在植物体中多以盐的形式存在，而弱碱性或呈中性的生物碱多以不稳定的盐以及游离碱的形式存在。故常用弱酸为溶剂将生物碱成分转化为盐的形式，采用酸水提取。
3）醇提取
游离形式存在的生物碱或以盐形式存在的生物碱一般都能溶于醇溶液，因而采用醇提法提取生物碱成分较为普遍。
4）碱化-有机溶剂提取
对于以盐的形式存在的生物碱，预先用碱水处理，可将其转化为游离的形式，再采用有机溶剂进行提取。
5）酸水-碱化-亲脂性溶剂提取
该法在实验室中较为常用，使用于大多数生物碱成分的提取。经过酸水处理，将植物中的生物碱成分都转化为盐的形式，经酸水提出后，再进行碱化，将生物碱转化为游离的形式，最终采用亲脂性溶剂，将总碱部位提出。如蜡梅中生物碱的提取，先采用甲醇对药材浸提4次，获得的浸提物经10%的乙酸溶液溶解，通过乙酸乙酯萃取多次，获得的水相部位经Na2cCO3处理（pH=10），再采用氯仿萃取方法，最终获得总碱成分叫[28]
1.5.2.2 单体生物碱的分离和结构解析
总生物碱的进一步分离纯化，一直是天然产物化学中的一个难点。目前实验室中多采用色谱分离法，包括采用硅胶吸附剂、氧化铝分离材料、反相材料或葡聚糖凝胶等，半制备的HPLC也越来越普及，适用于碱性物质分离的色谱柱也被大量研制出来。
蜡梅属植物中富含生物碱类化学成分，目前已从其他蜡梅属植物中获得的生物碱单
体化合物有（+）-calycanthine、（一）-calycanthidine、（一）-chimonanthine、（一）-chimonanthidine、（一）-fblicanthine、（+）-calycanthidine、（+）-chimonanthine、（+）-fblicanthine、chimonamidine>CPC-1、CPC-2、meso-chimonanthine、tryptamine、Na，Nb-dimethyitryptamine、3-methy-Icarboxymethyl-indole-l-N-β-D-glucopyranoxide[52]。本项目组对柳叶蜡梅的生物碱类化学成分进行细致的研究，共发现8个生物碱单体化合物salicifoxazineA、salicifoxazineB、（一）-chimonanthine、meso-chimonanthine、（—）-fblicanthine、（+）-caIycanthine、（一）-iso-calycanthine和（3aR，3'aR，8-8a，8′-8′a）-tetradehydroisocalycanthine，其中salicifoxazineA和salicifoxazineB是一类具有新颖的氮氧结构片段的全新生物碱（图1-8）[31]。
1）化合物（一）-chimonanthidine的结构鉴定
（一）-chimonanthidine具有二聚吡咯并口吲哚结构，广泛分布于蜡梅属的植物中。（一）-chimonanthidine的结构鉴定过程如下：
无定形粉末；[a]20-285°（c0.05，EtOH）；HR-FABMSm/z361.2392[M+H]+，确定分子式为C23H28N4该分子式中包含12个不饱和度。1H4-NMR图谱中，3个甲基质δ2.36、2.84、2.98分别连接于氮原子上，结合13C-NMR图谱信息，该生物碱与已知生物碱chimonanthine、folicanthine、calycanthidine等具有相同的二聚吡咯并口吲哚型骨架。（一）-chimonanthidine的结构进一步通过二维以及合成的方法确定。（一）-chimonanthidine的绝对构型进一步通过与己知化合物（一）-fblicanthine的圆二色谱（CD）对比确定（图1-9）。
（一）-chimonanthidine1H-NMRCCDCh，600MHz）:2.03～2.07QH，m，H-3，3'），2.24～2.3I（1H，m，H-3'），2.36（3H，s，M-C%），2.44-2.51（3H，m，H-2，3，2'），2.61～2.64（1H，m，H-2），2.84（3H，s，N8′-CH3）2.94～2.97（1H，m，H-2'），2.98（3H，s，M-CH3），4.18（1H，br-s，H-8a），4.58（1H，br-s，H-8'a），6.24（1H，d，J=8.1Hz，H-7'），6.34（1H，d，J=7.8Hz，H-7），6.52（1H，dd，J=7.4Hz，7.4Hz，H-5'），6.56（1H，dd，J=7.6Hz，7.6Hz，H-5），7.00～7.06（4H，m，H-4，6，4'，6'）；i3c-NMR（CDCh，150MHz）:31.1（%'（此），35.0（C-3），35.3（N8-CH3），38.2（C-3'），38.3（N1-CH3），45.6（C-2'），53.0（C-2），62.4（C-3a，3'a），87.2（C-8'a），92.5（C-8a），104.7（C-7，），106.2（C-7），106.2（C-5'），116.9（C-5），124.3（C-4'），124.4（C-4），128.4（06，6'），131.8（C-3'b），132.6（C-3b），152.5（C-7′a），152.8（C-7a）。
2）化合物salicifoxazineA和salicifoxazineB的结构鉴定
SalicifoxazineA为淡黄色油状物，HR-ESIMSm/z363.2176[M+H]+，确定分子式为C22H26N4O。，H-NMR和13C-NMR谱中（表1-11）包含了两套相似的信号，意味着该生物碱可能为二聚化合物。在1H-NMR谱中显示以下官能团的信号：两个单峰连氮甲基质子（δ2.27，2.41；N1-Me，N，-Me）；四个亚甲基质子（δ2.44，m，H2-2；δ2.63，ddd，Ha-3；δ1.71，dt，J=11.8Hz，4.9Hz，Hb-3；δ2.66，ddd，overlapped，Ha-2'；62.33，td，J=11.3Hz，3.5Hz，Hb-2；δ2.45，m，Ha-3；δ2.02，dddJ=13.3Hz，3.5Hz，2.2Hz，Hb-3′）；两个连着杂原子的次甲基质子（δ4.47，brs，H-8a；δ5.11，brs，H-8a′）；两对AA′BB′系统的芳香氢原子信号（δ7.16，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4；δ6.74，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5；δ7.07，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6；δ6.61，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7和δ7.21，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-4'；δ6.86，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-5'；57.17，td，J=7.5Hz，1.0Hz，H-6'；56.71，dd，J=7.5Hz，1.0Hz，H-7′）。与之相对应的碳谱显示了22个碳信号：两个连氮甲基（δ37.2和46.3）；四个亚甲基（δ52.9和34.3；δ53.8和27.3）；两个季碳信号（δ64.1和50.9）；链各个连接杂原子的次甲基（δ85.2和93.2）；两对邻位取代的苯环（δ125.7，118.6，128.3，109.2，151.1，132.3；δ125.1，118.8，128.5，109.5，151.1，129.4）。此外，紫外吸收光谱中241nm和298nm处的吸收波长表明PhNCN发射官能团的存在。
上述NMR数据与已知化合物（一）-chimonanthine有着高度相似，说明salicifoxazineA也是一个二聚色胺生物碱。与（一）-chimonanthine不同的是，㈠-chimonanthine中N1-Me的化学位移在37.4，而salicifoxazineA的在46.3，（一）-chimonanthine中C-8a，在&85.6，而salicifoxazineA的在&93.2。这两个向低场迁移的信号，说明N1和C-8a′之间插入了一个氧原子，从而形成具有独特的嗪六元环的结构。由此可以推断出salicifoxazineA的平面结构。
止匕外，salicifoxazineA的旋光值为[a]-243.9。（c-0.37，MeOH），该值与已知化合物（一）-chimonanthine[a]20-310°（c0.80，EtOH）和（一）-chimonanthidine[a]20-285°（c0.05，EtOH）相近。进一步测定salicifoxazineA的CD图谱（图1-10），其CD图谱与已知化合物（一）-chimonanthidine（图1-9）相似。由此可以推断出salicifoxazineA的结构如图1-8所示。
SalicifbxazineB的HR-ES1MSm/z385.1995[M+Na]+，确定分子式为C22H26N4O，且其NMR图谱与salicifbxazineA的高度相似，可知salicifoxazineB的平面结构与salicifoxazineA相同。与salicifoxazineA不同的是，salicifoxazineB的旋光值为[a]20-2.2°，该值与meso-chimonanthine的[a]20相近。此外，salicifbxazineB的CD图谱并未见明显的Cotton效应，且手性柱分析该化合物为手性纯化合物，说明salicifoxazineB为内消旋化
