宁德市图书馆 内容
DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别的辅助手段和有效补充。
（―）中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则的建立
为解决中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，陈士林团队基于大量实验样本在国际上首先验证并确立ITS2序列作为药用植物通用条形码，并在大量中药材基原物种及其混伪品的鉴定工作中得到良好应用。随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及，国家药典委员会于2012年讨论通过在《中国药典》（2010年版）增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，该指导原则已收录至《中国药典》（2015年版）通则中，使中药材DNA条形码鉴定进一步规范化。该指导原则主要内容为以ITS2为主体条形码序列的中药材鉴定方法体系，其中植物类中药材选用ITS2/ITS为主体序列，以叶绿体psbA-tmH为辅助序列，动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列。
（二）DNA条形码技术在中药材鉴定中的应用
中药材品种繁多，习用品、代用品及多基原、同名异物、同物异名等现象一直是影响中药安全性、有效性的重要问题。传统的基原、性状、显微和理化鉴定等方法对鉴定者的专业水平和经验依赖性较强，易受主观因素的影响，同时也存在局限性，难以满足实际工作需求。
以ITS2为主、psbA-trnH为辅的植物类药材的DNA条形码鉴定体系和以COI为主的动物类药材的DNA条形码鉴定体系已收录为《中国药典M2015年版）四部通则之一，DNA条形码技术在中药材领域的应用必将促使我国中药材市场更加标准化、规范化，与时俱进。基于大量中药材样本DNA条形码鉴定研究，ITS2已成为植物类药材有效的鉴定工具，从基因层面解决了中药材与混伪品的物种识别问题，创建中药材DNA条形码分子鉴定体系，为中草药建立了“基因身份证”。2012年和2015年，陈士林团队先后出版的专著《中药DNA条形码分子鉴定》和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》，奠定了我国中药材DNA条形码分子鉴定体系的理论和应用基础，标志着中药鉴定学迈入通用化、标准化基因鉴定时代。
(三)DNA条形码分子鉴定技术流程
1.样品釆集与保存
对于中药材原植物，釆集用作DNA条形码研究的实验材料应为健康、新鲜，没被真菌、细菌和病毒等感染的叶片、花、芽、果实或种子等组织或器官，要遵循一定的采样规范，注意样本个数、压制凭证标本、拍摄原植物照片及生境照片，并详细观察记录原植物形态特征，同时用GPS仪定位，记录海拔等。
一般来说，新鲜材料采集后最好及时提取DNA，如在野外，不便提取，则应尽可能快地放在避光的冷环境中，如液氮罐、干冰箱、冰壶、冰袋中，并尽快运回实验室处理备用。对于那些分布在远离实验室交通极为不便的边远地区，要釆集和及时运输新鲜材料提取DNA十分困难，目前普遍釆取的取样和保存植物样品的方法是硅胶干燥法。
对于釆集回来的新鲜样品如要长期保存，应经液氮处理后储存在-80笆冰箱或直接储放于液氮中，且在与提取缓冲液接触前，应防止冰冻的样品在空气中融化，否则酚类易被氧化。对于已干燥好的植物材料，仍可置于塑料袋中，并留有少许硅胶，放在室温下的干燥器中几个月或长期储存在-80P冰箱中待用，但注意要密封好，以防吸潮。
2.DNA提取
中药材DNA的提取包括破碎细胞、释放核酸，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、沉淀与洗涤等步骤。
1)试剂盒法(适用于动物、植物和真菌类药材)
使用试剂盒与其他方法相比较更省时省力，方法相对简洁、易控，对于普通样品大多数实验室可采用商业化的试剂盒提取DNA，具体操作步骤参照相关试剂盒的说明书，使用时可根据需要进行调整，在大多数动物药材、植物药材中都获得了较为理想的结果。
2)CTAB法(适用于植物和真菌类药材)
(1)原药材用无水乙醇擦洗表面后，用刀片取其内部组织0.02〜0.1g，在液氮中迅速研磨使呈糊状或粉状，在研磨时及时加入少许抗坏血酸钠和聚乙烯毗咯烷酮(PVP)干粉(加入量视样品材料而定)，或用研磨仪进行研磨。
(2)将糊状或粉状物转入1.5〜2mL离心管后，加入600〜1000卩L65°C预热的2％十六烷基三甲基漠化铵(CTAB)提取液(2％CTAB，100mmol/LpH8.0Tris-HCl，1.4mol/LNaCI，20mmol/LEDTA)，0.1％〜2％好蔬基乙醇，放入水浴锅中65℃保温30-60min(对于保存时间较久的样品，可适当增加水浴时间)，其间温和混匀数次。
(3)12000r/min离心10min。将上层溶液转入另一个1.5mL离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，缓慢翻转离心管使内含物充分混匀后形成乳浊液，在12000r/min离心10min，小心取出上清液转入新离心管。
(4)重复上述步骤一次。
(5)取上清液，加入2/3体积的-20°C预冷的异丙醇，在-20°C下放置30min或过夜。
(6)在12000r/min离心10〜20min收集沉淀，70％〜75％乙醇清洗，室温下或超净工作台中自然风干DNAo
(7)将此沉淀加入合适体积的无菌双蒸水或TE(Tris-EDTA)缓冲液，4笆保存备用或放入-20°C保存。
3.PCR扩增
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是快速扩增DNA序列最常用的方法。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下这种循环的不断重复。各DNA条形码序列所用PCR通用引物如下：
ITS2片段
正向引物 ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAA「3，；
反向引物 ITS3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAA1^31»
psbA-trnH片段
正向引物：5，-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3，；
反向引物：5，-CGCGCATGGTG-GATTCACAATCC-3，。
COI序列
正向引物 LCO1490：5JGGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
反向引物 HCO2198：5，-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，o
PCR反应体系以25/L为参照，反应体系为：PCR缓冲液(10X)2.5gL，MgCl2(25mmol/L)2pL，三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)混合物(2.5mmol/L)2pL，上游和下游引物(2.5jimol/L)各1.0成，模板DNA，TaqDNA聚合酶1.0U，加无菌双蒸水至25jxL，也可根据具体情况加以调整。应设置未加模板DNA的阴性对照。ITS2序列扩增程序：94°C5min；94°C30s，56°C30s，72°C45s，36—40个循环；72°C10minopsbA-trnH序列扩增程序：94°C5min；94°C1min，55°C1min，72°C1.5min，30个循环；72°C7mineCOI序列扩增程序：94°C1min；94°C1min，45"C1.5min，72°C1.5min，5个循环；94°C1min，50°C1.5min，72°C1min，35个循环；72°C5min。其他DNA条形码序列PCR扩增引物应参考相关研究结果。
模板DNA浓度也是影响PCR扩增效果的一个重要因素。在最初扩增时需根据具体样品，设计模板浓度梯度，考察模板适宜浓度，以获得理想的扩增条带。
釆取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，阴性对照应无条带，目的产物如条带单一，可直接测序；如有多条带或出现拖尾现象，则需在紫外光下快速有效地切下所需片段所在位置的凝胶，然后再选用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，回收后的产物还要进一步经琼脂糖凝胶电泳检测后，测序。
测序原理同Sanger测序法，PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA序列测序仪进行双向测序，目前各地均有专业的测序服务公司进行DNA测序服务。
4.序列拼接流程
1)序列质量与方向
为确保DNA条形码序列的可靠性，序列拼接时，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量部分。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
2)序列拼接
应用专业的序列拼接软件进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接。获得高质量序列后，对于ITS2序列，根据HiddenMarkovModel(HMM)模型，去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列：对于psbA-trnH，根据GenBank数据库中同科属物种psbA-trnH的注释，去除序列两端的ps財和基因，获得完整的如H基因间隔区；CO1序列可直接进行后续分析。
5.物种鉴定流程
将获得的序列应用BLAST(basiclocalalignmentsearchtool)方法进行结果判定，BLAST法是通过两两序列局部比对来査询数据库中与之最匹配的序列。BLAST结果中相似性最高的序列对应的物种为查询序列对应的物种。可以在中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)或GenBank数据库中进行BLAST鉴定。
(四)畲药DNA条形码分子鉴定研究实例
食凉茶为蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属植物柳叶蜡梅(ChimonamhussalicifoliusS.Y.Hu)或浙江蜡梅(ChimonanthuszhejiangensisM.C.Liu)的干燥叶，又名食凉餐、食凉青、石凉撑、山蜡茶、黄金茶、香风茶等，是畲族应用最广的药材之一，有“畲药第一味”之称，以畲族习用药材名义收载于2015年版《浙江省中药炮制规范》。
由于食凉茶基原植物的化学成分及药理作用与同科蜡梅属其他物种如蜡梅\Chimonanthus praecox(L.) Link］、山蜡梅(Chimonanthus nitensOliv.)、西南蜡梅(Chimonanthus campanulatus R.H. Chang et C.S.Ding)和夏蜡梅属美国蜡梅(Calycanthus floridus L.)、夏蜡梅［Calycanthus chinensis (W.C.ChengetS.Y.Chang)W.C. Cheng etS. Y.Chang ex P.T. Li］存在明显差异，混用乱用严重影响食凉茶的临床疗效与用药安全，因此对其进行准确鉴定显得尤为重要。我们对食凉茶基原植物及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究。首先，釆集了多个区域的蜡梅属和夏蜡梅属的多种植物及部分商业茶产品，具体样品采集情况见表3-1。
经分析后发现，柳叶蜡梅23条ITS2序列的GC含量平均为71.23％，有3个单倍型单倍型A1有16条，占69.56％，A2有5条，占21.74％，A3有2条，占8.70％，种卩K2P遗传距离为0〜0.008；浙江蜡梅ITS2序列有15条，GC含量平均为71.07％，有:个单倍型，单倍型B1有14条，占93.33％，B2有1条，占6.67％，种内K2P遗传距富为0〜0.004，柳叶蜡梅与浙江蜡梅间K2P距离为0.004〜0.008（表3-2和表3-3）。其ft）近缘混伪品ITS2序列长度为256〜260bp，GC含量为70.98％〜72.73％。食凉茶基原効种及其混伪品ITS2序列长度、GC含量及品种间序列比对等具体情况见表3-2和图3-1畲药食凉茶基原物种与混伪品的种间遗传距离为0.004〜0.078，食凉茶基原物种柳叶蜉梅和浙江蜡梅与夏蜡梅种间K2P距离均最大（表3-3）。通过基于ITS2序列（单倍型）构建的食凉茶基原植物及其混伪品的NJ系统聚类树（图3-2）可以看出，食凉茶基原程物柳叶蜡梅和浙江蜡梅的序列聚为一支，其近缘物种蜡梅、山蜡梅、西南蜡梅、美国弟梅及夏蜡梅各自聚为一支，能够与食凉茶基原植物明显区分开。市场上流通的两个食讲茶商业茶样品Chl7、Chi8经鉴定其基原植物为柳叶蜡梅。上述蜡梅科7种植物的ITS：主导单倍型序列特征如图3-3所示。因此，ITS2序列可作为食凉茶的DNA条形码，帛够准确、有效地鉴别食凉茶基原植物及其混伪品。
（―）中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则的建立
为解决中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，陈士林团队基于大量实验样本在国际上首先验证并确立ITS2序列作为药用植物通用条形码，并在大量中药材基原物种及其混伪品的鉴定工作中得到良好应用。随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及，国家药典委员会于2012年讨论通过在《中国药典》（2010年版）增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，该指导原则已收录至《中国药典》（2015年版）通则中，使中药材DNA条形码鉴定进一步规范化。该指导原则主要内容为以ITS2为主体条形码序列的中药材鉴定方法体系，其中植物类中药材选用ITS2/ITS为主体序列，以叶绿体psbA-tmH为辅助序列，动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列。
（二）DNA条形码技术在中药材鉴定中的应用
中药材品种繁多，习用品、代用品及多基原、同名异物、同物异名等现象一直是影响中药安全性、有效性的重要问题。传统的基原、性状、显微和理化鉴定等方法对鉴定者的专业水平和经验依赖性较强，易受主观因素的影响，同时也存在局限性，难以满足实际工作需求。
以ITS2为主、psbA-trnH为辅的植物类药材的DNA条形码鉴定体系和以COI为主的动物类药材的DNA条形码鉴定体系已收录为《中国药典M2015年版）四部通则之一，DNA条形码技术在中药材领域的应用必将促使我国中药材市场更加标准化、规范化，与时俱进。基于大量中药材样本DNA条形码鉴定研究，ITS2已成为植物类药材有效的鉴定工具，从基因层面解决了中药材与混伪品的物种识别问题，创建中药材DNA条形码分子鉴定体系，为中草药建立了“基因身份证”。2012年和2015年，陈士林团队先后出版的专著《中药DNA条形码分子鉴定》和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》，奠定了我国中药材DNA条形码分子鉴定体系的理论和应用基础，标志着中药鉴定学迈入通用化、标准化基因鉴定时代。
(三)DNA条形码分子鉴定技术流程
1.样品釆集与保存
对于中药材原植物，釆集用作DNA条形码研究的实验材料应为健康、新鲜，没被真菌、细菌和病毒等感染的叶片、花、芽、果实或种子等组织或器官，要遵循一定的采样规范，注意样本个数、压制凭证标本、拍摄原植物照片及生境照片，并详细观察记录原植物形态特征，同时用GPS仪定位，记录海拔等。
一般来说，新鲜材料采集后最好及时提取DNA，如在野外，不便提取，则应尽可能快地放在避光的冷环境中，如液氮罐、干冰箱、冰壶、冰袋中，并尽快运回实验室处理备用。对于那些分布在远离实验室交通极为不便的边远地区，要釆集和及时运输新鲜材料提取DNA十分困难，目前普遍釆取的取样和保存植物样品的方法是硅胶干燥法。
对于釆集回来的新鲜样品如要长期保存，应经液氮处理后储存在-80笆冰箱或直接储放于液氮中，且在与提取缓冲液接触前，应防止冰冻的样品在空气中融化，否则酚类易被氧化。对于已干燥好的植物材料，仍可置于塑料袋中，并留有少许硅胶，放在室温下的干燥器中几个月或长期储存在-80P冰箱中待用，但注意要密封好，以防吸潮。
2.DNA提取
中药材DNA的提取包括破碎细胞、释放核酸，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、沉淀与洗涤等步骤。
1)试剂盒法(适用于动物、植物和真菌类药材)
使用试剂盒与其他方法相比较更省时省力，方法相对简洁、易控，对于普通样品大多数实验室可采用商业化的试剂盒提取DNA，具体操作步骤参照相关试剂盒的说明书，使用时可根据需要进行调整，在大多数动物药材、植物药材中都获得了较为理想的结果。
2)CTAB法(适用于植物和真菌类药材)
(1)原药材用无水乙醇擦洗表面后，用刀片取其内部组织0.02〜0.1g，在液氮中迅速研磨使呈糊状或粉状，在研磨时及时加入少许抗坏血酸钠和聚乙烯毗咯烷酮(PVP)干粉(加入量视样品材料而定)，或用研磨仪进行研磨。
(2)将糊状或粉状物转入1.5〜2mL离心管后，加入600〜1000卩L65°C预热的2％十六烷基三甲基漠化铵(CTAB)提取液(2％CTAB，100mmol/LpH8.0Tris-HCl，1.4mol/LNaCI，20mmol/LEDTA)，0.1％〜2％好蔬基乙醇，放入水浴锅中65℃保温30-60min(对于保存时间较久的样品，可适当增加水浴时间)，其间温和混匀数次。
(3)12000r/min离心10min。将上层溶液转入另一个1.5mL离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，缓慢翻转离心管使内含物充分混匀后形成乳浊液，在12000r/min离心10min，小心取出上清液转入新离心管。
(4)重复上述步骤一次。
(5)取上清液，加入2/3体积的-20°C预冷的异丙醇，在-20°C下放置30min或过夜。
(6)在12000r/min离心10〜20min收集沉淀，70％〜75％乙醇清洗，室温下或超净工作台中自然风干DNAo
(7)将此沉淀加入合适体积的无菌双蒸水或TE(Tris-EDTA)缓冲液，4笆保存备用或放入-20°C保存。
3.PCR扩增
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是快速扩增DNA序列最常用的方法。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下这种循环的不断重复。各DNA条形码序列所用PCR通用引物如下：
ITS2片段
正向引物 ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAA「3，；
反向引物 ITS3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAA1^31»
psbA-trnH片段
正向引物：5，-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3，；
反向引物：5，-CGCGCATGGTG-GATTCACAATCC-3，。
COI序列
正向引物 LCO1490：5JGGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
反向引物 HCO2198：5，-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，o
PCR反应体系以25/L为参照，反应体系为：PCR缓冲液(10X)2.5gL，MgCl2(25mmol/L)2pL，三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)混合物(2.5mmol/L)2pL，上游和下游引物(2.5jimol/L)各1.0成，模板DNA，TaqDNA聚合酶1.0U，加无菌双蒸水至25jxL，也可根据具体情况加以调整。应设置未加模板DNA的阴性对照。ITS2序列扩增程序：94°C5min；94°C30s，56°C30s，72°C45s，36—40个循环；72°C10minopsbA-trnH序列扩增程序：94°C5min；94°C1min，55°C1min，72°C1.5min，30个循环；72°C7mineCOI序列扩增程序：94°C1min；94°C1min，45"C1.5min，72°C1.5min，5个循环；94°C1min，50°C1.5min，72°C1min，35个循环；72°C5min。其他DNA条形码序列PCR扩增引物应参考相关研究结果。
模板DNA浓度也是影响PCR扩增效果的一个重要因素。在最初扩增时需根据具体样品，设计模板浓度梯度，考察模板适宜浓度，以获得理想的扩增条带。
釆取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，阴性对照应无条带，目的产物如条带单一，可直接测序；如有多条带或出现拖尾现象，则需在紫外光下快速有效地切下所需片段所在位置的凝胶，然后再选用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，回收后的产物还要进一步经琼脂糖凝胶电泳检测后，测序。
测序原理同Sanger测序法，PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA序列测序仪进行双向测序，目前各地均有专业的测序服务公司进行DNA测序服务。
4.序列拼接流程
1)序列质量与方向
为确保DNA条形码序列的可靠性，序列拼接时，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量部分。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
2)序列拼接
应用专业的序列拼接软件进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接。获得高质量序列后，对于ITS2序列，根据HiddenMarkovModel(HMM)模型，去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列：对于psbA-trnH，根据GenBank数据库中同科属物种psbA-trnH的注释，去除序列两端的ps財和基因，获得完整的如H基因间隔区；CO1序列可直接进行后续分析。
5.物种鉴定流程
将获得的序列应用BLAST(basiclocalalignmentsearchtool)方法进行结果判定，BLAST法是通过两两序列局部比对来査询数据库中与之最匹配的序列。BLAST结果中相似性最高的序列对应的物种为查询序列对应的物种。可以在中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)或GenBank数据库中进行BLAST鉴定。
(四)畲药DNA条形码分子鉴定研究实例
食凉茶为蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属植物柳叶蜡梅(ChimonamhussalicifoliusS.Y.Hu)或浙江蜡梅(ChimonanthuszhejiangensisM.C.Liu)的干燥叶，又名食凉餐、食凉青、石凉撑、山蜡茶、黄金茶、香风茶等，是畲族应用最广的药材之一，有“畲药第一味”之称，以畲族习用药材名义收载于2015年版《浙江省中药炮制规范》。
由于食凉茶基原植物的化学成分及药理作用与同科蜡梅属其他物种如蜡梅\Chimonanthus praecox(L.) Link］、山蜡梅(Chimonanthus nitensOliv.)、西南蜡梅(Chimonanthus campanulatus R.H. Chang et C.S.Ding)和夏蜡梅属美国蜡梅(Calycanthus floridus L.)、夏蜡梅［Calycanthus chinensis (W.C.ChengetS.Y.Chang)W.C. Cheng etS. Y.Chang ex P.T. Li］存在明显差异，混用乱用严重影响食凉茶的临床疗效与用药安全，因此对其进行准确鉴定显得尤为重要。我们对食凉茶基原植物及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究。首先，釆集了多个区域的蜡梅属和夏蜡梅属的多种植物及部分商业茶产品，具体样品采集情况见表3-1。
经分析后发现，柳叶蜡梅23条ITS2序列的GC含量平均为71.23％，有3个单倍型单倍型A1有16条，占69.56％，A2有5条，占21.74％，A3有2条，占8.70％，种卩K2P遗传距离为0〜0.008；浙江蜡梅ITS2序列有15条，GC含量平均为71.07％，有:个单倍型，单倍型B1有14条，占93.33％，B2有1条，占6.67％，种内K2P遗传距富为0〜0.004，柳叶蜡梅与浙江蜡梅间K2P距离为0.004〜0.008（表3-2和表3-3）。其ft）近缘混伪品ITS2序列长度为256〜260bp，GC含量为70.98％〜72.73％。食凉茶基原効种及其混伪品ITS2序列长度、GC含量及品种间序列比对等具体情况见表3-2和图3-1畲药食凉茶基原物种与混伪品的种间遗传距离为0.004〜0.078，食凉茶基原物种柳叶蜉梅和浙江蜡梅与夏蜡梅种间K2P距离均最大（表3-3）。通过基于ITS2序列（单倍型）构建的食凉茶基原植物及其混伪品的NJ系统聚类树（图3-2）可以看出，食凉茶基原程物柳叶蜡梅和浙江蜡梅的序列聚为一支，其近缘物种蜡梅、山蜡梅、西南蜡梅、美国弟梅及夏蜡梅各自聚为一支，能够与食凉茶基原植物明显区分开。市场上流通的两个食讲茶商业茶样品Chl7、Chi8经鉴定其基原植物为柳叶蜡梅。上述蜡梅科7种植物的ITS：主导单倍型序列特征如图3-3所示。因此，ITS2序列可作为食凉茶的DNA条形码，帛够准确、有效地鉴别食凉茶基原植物及其混伪品。
