宁德市图书馆

畲药的理化鉴定是利用物理化学分析方法，对畲药进行定性、定量分析，以鉴定其真伪和品质优劣的方法。一般理化鉴定包括物理常数、呈色反应、沉淀反应、泡沫反应、微量升华、显微化学反应、荧光分析、容量分析等。由于理化鉴定技术发展很快，新的分析手段和方法不断涌现，现将常用的、基于仪器设备的理化鉴定方法介绍如下。
  —、分光光度法
  分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、荧光分光光度法等。
  （一）紫外-可见分光光度法
  紫外-可见分光光度法是在190～800mn波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
  从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长ymax就和最小吸收波长;Imin。物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
  紫外-可见分光光度法不仅能测定有色物质，对有共轭双键等结构的无色物质也能测定，具有灵敏、准确、简便等特点。畲药中含有紫外吸收的成分或本身有颜色的成分，在一定浓度范围内，其溶液的吸光度与浓度符合朗伯-比尔定律，均可以采用该方法进行分析。有些成分本身没有吸收，但加入合适的显色试剂显色后也可釆用此法测定。该法适合用于测定畲药中的大类成分，如总黄酮、总蔥醌、总皂苷的测定。
  仪器的校正和检定、对溶剂的要求、测定法等内容参见《中国药典》四部通则0401“紫外-可见分光光度法
  （二） 红外光谱法
  1.红外分光光度法
  红外分光光度法是在4000～400cm-1’波数范围内测定物质的吸收光谱，用于化合物的鉴别、检查或含量测定的方法。除部分光学异构体及长链烷烴同系物外，几乎没有两个化合物具有相同的红外光谱，据此可以对化合物进行定性和结构分析；化合物对红外辐射的吸收程度与其浓度的关系符合朗伯-比尔定律，是红外分光光度法定量分析的依据。
  制备及测定供试品时，通常釆用压片法、糊法、膜法、溶液法和气体吸收法等进行测定。对于吸收特别强烈或不透明表面上的覆盖物等供试品，可采用如衰减全反射、漫反射和发射等红外光谱方法。对于极微量或需微区分析的供试品，可釆用显微红外光谱方法测定。除另有规定外，应按照国家药典委员会编订的《药品红外光谱集》各卷收载的各光谱图所规定的方法制备样品。具体操作技术参见《药品红外光谱集》的说明。仪器及其校正、供试品的制备及测定等内容参见《中国药典》四部通则0402“红外分光光度法”。
  2.近红外分光光度法
  近红外分光光度法是通过测定物质在近红外光谱区（波长范围在780～2500nm，按波数计为12800～4000cmT）的特征光谱并利用化学计量学方法提取相关信息，对物质进行定性、定量分析的一种光谱分析技术。近红外光谱主要由C—H、N—H、O—H和S-H等基团基频振动的倍频和合频组成，由于其吸收强度远低于物质中红外光谱（4000～400cm-1）的基频振动，而且吸收峰重叠严重，因此通常不能直接对其进行解析，而需要对测得的光谱数据进行数学处理后，才能进行定性、定量分析。
  近红外分光光度法具有快速、准确、对样品无破坏的检测特性，不仅能进行“离线”分析，还能直接进行“在线”过程控制；不仅可以直接测定原料和制剂中的活性成分，还能对药品的某些理化性质如水分、脂肪类化合物的羟值、碘值和酸值等进行分析；并能对药物辅料、中间产物以及包装材料进行定性和分级。
  近红外仪器装置、测量模式、影响因素、应用近红外分光光度法进行定性、定量分析的基本要求、模型验证、模型传递等内容参见《中国药典》四部指导原则9104“近红外分光光度法指导原则”。
  （三）原子吸收分光光度法
  原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素，是基于测量蒸气中原子对特征电磁辐射的吸收强度进行定量分析的一种仪器分析方法。原子吸收分光光度法遵循分光光度法的吸收定律，一般通过比较对照品溶液和供试品溶液的吸光度，计算供试品中待测元素的含量。原子吸收分光光度法是目前用于分析畲药中微量元素的重要方法之一。对仪器的一般要求、测定法等内容参见《中国药典》四部通则0406“原子吸收分光光度法”。
  二、色谱法
  色谱分析法又称层析法，是指溶质因吸附、分配、溶解性能、分子大小或离子电荷等不同，在相对运动的两相系统中差速迁移而达到分离，从而对被分离的组分进行定性、定量分析的一种方法。根据分离方法的不同，色谱法可分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法等。由于色谱法的分离分析功能和高专属性等特点，被各国药典广泛用于各类药物的含量测定、杂质检查和鉴别试验。其中高效液相色谱法是畲药含量测定中使用率最高的一种方法。
  （一）薄层色谱法
  薄层色谱法（thin-layerchromatography，TLC）是将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。但由于定量技术更新迭代速度较快，薄层色谱法目前较少用于定量。标准物质包括化学对照品、对照提取物或对照药材等。对于有色物质，直接观察色斑；对于无色物质，可在紫外光（254nm或365nm）下检视，或喷显色剂加以显色，或在薄层硅胶中加入荧光物质，釆用荧光猝灭法检视。
  薄层色谱鉴别法的建立原则是分离度好、图谱清晰、斑点明显、重现性好。系统适用性试验包括比移值（竹）、检出限、分离度（或分离效能）和相对标准偏差。比移值是指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂的前沿距离的比值。
  薄层色谱法具有简便、快速、灵敏、专属性强等优点，在中药及其制剂的鉴别中被广泛应用。仪器与材料、操作方法、系统适用性试验、测定法等内容参见《中国药典》四部通则0502“薄层色谱法”。
  （二）高效液相色谱法
  高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。高效液相色谱法具有分离效能高、专属性强、重现性好、精密准确等优点，是畲药含量测定的首选方法，用于鉴别时，要求供试品和对照品色谱峰的保留时间应一致。
  根据固定相类型，高效液相色谱法可分为分配色谱、吸附色谱或离子交换色谱等。根据固定相与流动相极性大小，又可分为正相色谱法（NP-HPLC，通常为吸附机制）和反相色谱法（RP-HPLC，通常以分配机制为主）。RP-HPLC法最常用的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，适合用于中等极性或非极性的弱酸、弱碱和中性化合物的分离分析，绝大部分化学成分可使用RP-HPLC法进行定量、定性分析。
  高效液相色谱法中应用的检测器包括选择性检测器（紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器）和通用性检测器（示差折光、蒸发光散射检测器），前者响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关，而后者对所有化合物均有响应，此外还有更专属、更灵敏的质谱检测器。
  各国药典对色谱系统的适用性试验均作了规定。在每次开机后，用规定的对照品对仪器进行调试，分析测试色谱柱的理论塔板数（柱效）、待测组分之间的分离度、重复进样色谱峰面积的精密度和色谱峰的拖尾因子，须达到规定的要求，保证分析的精确度。
  对仪器的一般要求和色谱条件、系统适用性试验、测定法（内标法、外标法等）等内容参见《中国药典》四部通则0512"高效液相色谱法”。
  随着分离科学的飞速发展，超高效液相色谱法（ultraperformanceliquidchromatography，UPLC）使液相色谱在更高水平上实现了突破。UPLC借助HPLC的理论和原理，利用小颗粒固定相（1.7nm）非常低的系统体积及快速检测手段等全新技术，使分离度、检测灵敏度及色谱峰容量等大大提高，从而全面提升了液相色谱的分离效能。与传统的HPLC相比，UPLC的分析速度、检测灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，因此大幅度节约了分析时间，节省了溶剂，很大程度上拓宽了液相色谱的应用范围。
  （三）气相色谱法
  气相色谱法（gaschromatography，GC）是釆用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号。
  气相色谱法具有分离效能高、专属性强、灵敏度高、重现性好、分析速度快等优点，但受样品蒸气压限制，主要用于具有挥发性成分的含量测定，同时可进行鉴别。挥发性小的样品需釆用衍生或裂解以增加挥发性，但操作繁琐，而且样品不易复原。因此，气相色谱法常用于含挥发油或其他挥发性成分的鉴别。气相色谱法系统适用性试验与鉴别方法同高效液相色谱法。
  气相色谱法的色谱柱分为填充柱和毛细管柱。填充柱的材质为玻璃或不锈钢，内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体：毛细管柱的材质多为石英，内壁或载体经涂渍或交联固定液。气相色谱法用作流动相的载气有氮气、氢气和氢气。除另有规定外，常用载气为氮气。
  气相色谱法的进样方式一般可釆用直接进样或顶空进样。检测器有多种，包括火焰离子化检测器（FID）、氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）、电子捕获检测器（ECD）、热导检测器（TCD）、质谱检测器（MS）等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的药物；氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高；火焰光度检测器对含磷、硫元素的化合物灵敏度高；电子捕获检测器适于含卤素的化合物；质谱检测器还能给出供试品某个成分相应的结构信息，可用于结构确证。除另有规定外，一般用火焰离子化检测器，以氢气作为燃气，空气作为助燃气。
  对仪器的一般要求、系统适用性试验、测定法等内容参见《中国药典》四部通则0521“气相色谱法”。
  三、色谱-质谱联用法
  质谱法（massspectrometry，MS）是使待测化合物产生气态离子，再按质荷比（m/z）将离子分离、检测的分析方法。质谱法应用多种离子化技术（如高能电子流轰击、化学电离、强电场作用等），使物质分子失去外层价电子形成分子离子，分子离子中的化学键又继续发生某些有规律的断裂而形成不同质量的碎片离子。分子离子和碎片离子由质量分析器将其分离并按质荷比大小依次进入检测器，信号经过放大、记录得到质谱图。质谱法可提供分子质量和结构的信息，定量测定可釆用内标法或外标法，检测限可达10-'5～10-12mol数量级。质谱是物质固有特性之一，不同物质除一些异构体外，均有不同的质谱，质谱峰的强度与其代表的物质的含量成正比，据此可进行定量分析。质谱法具有高灵敏度和高选择性等特点，是目前痕量有机分析最有效的手段之一，在天然药物复杂体系分析、体内药物分析中有着广泛的应用。
  色谱法具有高分离效能，质谱法具有强大的结构解析能力，将色谱与质谱联用可以充分发挥各自的长处，获得单一技术所无法得到的信息，可对复杂体系样品进行定性、定量分析，在畲药分析中有一定应用前景。色谱-质谱联用技术主要有气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）、毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）、超临界流体色谱-质谱联用（SFC-MS），其中LC-MS已广泛用于药物分析。色谱-质谱联用技术的关键是接口。
  早期的色谱-质谱联用仪使用单级四级杆质谱，在分析复杂基质样品时，难以排除基质的干扰，不易解决共流出化合物的定性和定量，也无法区分同分异构化合物。采用多级质谱技术，通过提取目标离子进一步碎裂的方式获取更多的分子信息，可以解决上述问题。目前主流的质谱技术按其质量分析器分类包括：四级杆质谱、飞行时间质谱、离子阱质谱、磁质谱、傅里叶变换离子回旋共振质谱等。由于各种质量分析器均有自己的优缺点，将不同类型的质谱仪串联起来，进行时间上或空间上两级质量分析的结合，可取长补短，大幅度提高性能。目前多级质谱与色谱的联用已成为主流技术，常用的如三重四级杆（triple quadrupole，Q-q-Q）、线性离子阱/四级杆-轨道离子阱（linearion trap/quadrupole-orbitr叩，LTQ/Q-orbitrap）、四级杆-飞行时间（quadrupole time-o「Hight，Q-TOF）等。
  （一）气相色谱-质谱联用技术
  GC-MS由气相色谱、质谱、接口和数据处理系统组成。由于气相色谱的试样、流动相都呈气态，与质谱仪的进样要求相匹配，因此GC-MS是最成熟的两谱联用技术。接口是GC-MS的关键技术，其功能主要有两方面：一是使色谱柱出口压力与质谱仪离子源的压力相匹配（GC色谱柱出口通常是常压，而MS离子源呈真空状态）；二是排除大量载气和过量色谱流出物，使色谱流出组分经浓缩后适量地进入离子源。常用的接口有分子分离器（包括喷射式分子分离器、微孔玻璃分子分离器、硅橡胶膜分子分离器）、开口分流分离器和用毛细管直接连接三种。
  GC-MS的工作原理：多组分混合物样品先经色谱单元，分离后的各单一组分按其不同的保留时间和载气一起流出色谱柱，经接口进入质谱仪的离子源。有机分子在高真空下，受电子流轰击或强电场作用，离解成各具特征的碎片离子和分子离子，这些带正电荷的离子具有不同质荷比（即相对离子质量与电荷之比），在磁场中被分离。收集、记录这些离子的信号及强度，可得总离子流色谱图和各组分的色谱图。由质谱图可获得有关质量与结构方面的信息。
  GC-MS可对复杂混合物进行定性、定量分析。目前GC-MS最主要的定性方式是库检索。将在标准电离条件下得到的各种化合物的标准质谱图存储在计算机中，作为质谱谱库，然后在相同条件下得到的未知化合物的质谱图与质谱谱库中的标准质谱按一定程序进行比较，检出匹配度（相似度）高的化合物，给出其名称、相对分子质量、分子式、结构式和匹配度等，这个过程称为质谱数据检索。GC-MS定量分析方法类似于色谱法定量分析。由GC-MS得到的总离子流色谱图或质量色谱图，其色谱峰面积与相应组分的含量成正比，若对某一组分进行定量测定，可以釆用色谱分析法中的归一化法、外标法、内标法等不同方法进行。
  （二）液相色谱-质谱联用技术
  LC-MS由液相色谱、质谱、接口技术和数据处理系统组成。样品经LC分离后，在接口部分，样品分子完成离子化过程后进入质谱。LC与MS的接口技术是困扰液相色谱-质谱联用技术发展的最主要难题，从某种意义上讲，液相色谱-质谱联用技术的发展也可以说是接口技术的发展。
  在LC-MS的发展进程中，先后引入了多种接口技术，主要有粒子束、直接导入、传动带、热喷雾等，这些接口技术都有不同程度的限制和缺陷而未能被广泛应用。直到大气压电离接口技术成熟后，LC-MS才得到了飞速发展。大气压电离是利用待测试样与溶剂电离能力的不同，在大气压条件下电离，利用电场导引，将带电试样导入质谱真空系统，这种接口技术更容易和LC匹配。目前常用的大气压电离接口技术有电喷雾电离（electrosprayionization，ESI）＞大气压化学电离（atmosphericpressurechemicalionization，APCI）及大气压光电离（atmosphericpressurephotoionization，APPI）等方式。
  LC-MS工作原理与GC-MS类似，作为关键技术，接口的主要作用是去除溶剂并使组分离子化。样品通过液相色谱分离，而后进入接口，去除溶剂并离子化后进入质谱的质量分析器中，根据质荷比的大小对离子进行分离，检测器接收分离后的离子，并将离子信号转变为电信号放大后输出，输出的信号经过计算机釆集和处理后，可以得到总离子流色谱图、质量色谱图、质谱图等。
  LC-MS技术具备了LC的高效分离性能和MS的强大结构解析能力，能够快速地同时对混合物成分进行定性和定量分析，分析的化合物种类广泛，能够分析极性大、挥发性差和热不稳定的化合物，并具有高选择性和高灵敏度，非常适于复杂样品的分析。
  四、中药（天然药物）指纹图谱和特征图谱
  中药（天然药物）是多组分复杂体系，其药效是所含的多种化学成分通过多靶点、多环节发挥综合作用的结果，因此，仅分析测定某一种或者某几种主要化学成分来评价其质量是不科学的，尤其是在很多天然药物（如畲药）有效成分尚不明确的情况下，综合的质量评价方法成为客观要求，中药（天然药物）指纹图谱由此应运而生。
  中药（天然药物）指纹图谱是指某些药材、提取物或制剂经适当处理后，利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现研究对象性质的图形、图像、图谱及其数据。中药（天然药物）指纹图谱是一种综合的可量化的鉴定手段，它是建立在中药（天然药物）化学成分系统研究的基础上，主要用于评价研究对象的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。利用指纹图谱的整体性，可以鉴别中药（天然药物）的真伪，评价原药材与成方制剂的相关性等。模糊性强调的是待测样品的指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似性，而不是相同性。模糊性由药材来源的多样性（产地、采收加工等）、化学成分的复杂性和可变性等特点决定，因此指纹图谱是相对“模糊”的。
  以指纹图谱作为中药（天然药物）的质量控制方法，已成为目前国际共识，各种符合中药（天然药物）特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立。美国食品药品监督管理局（FDA）允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱；世界卫生组织《WHO草药评价指南》（1996年）中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致；欧洲共同体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。国外指纹图谱的应用，目的在于解决成分复杂，有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。德国研制的银杏叶提取物制剂就是一个典型案例。他们应用指纹图谱制定了相应的标准，该图谱体现了制剂所含的33个化学成分（主要为黄酮类和内酯类）和各自的含量。经过30多年的化学成分和药效相关性研究发现，约24％银杏黄酮和约6％银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。此外，釆用“混批勾兑”法，可使最终产品质量稳定，指纹图谱重现性良好，含量浮动范围为5％左右。
  狭义的中药（天然药物）指纹图谱主要指中药（天然药物）的化学指纹图谱，广义而言，还包括生物指纹图谱如DNA指纹图谱、基因组和蛋白组指纹图谱等。此外，按照中医药的特点，指纹图谱研究可深化发展成为谱效学，即指纹特征和药效相关性研究的指纹图谱的生物等效性研究。
  目前，中药（天然药物）指纹图谱技术已涉及众多方法，包括TLC、HPLC、GC和高效毛细管电泳（HPCE）等色谱法以及紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、近红外光谱（NIR）、MS、核磁共振（NMR）和X射线衍射等光谱法。由于色谱具有分离和鉴别两种功能，加上量化的数据，提供的质量信息一般要比光谱要丰富，因此色谱法尤其是LC，已成为中药（天然药物）指纹图谱技术的首选方法，其他色谱技术如GC、HPCE等也有较多应用。此外，随着HPLC-MS和GC-MS等联用技术的应用，指纹图谱技术更趋完善。
  特征图谱是指样品经过适当处理后，釆用一定分析手段和仪器检测得到的能够标识其中各组分群特征的共有峰的图谱。特征图谱是目前中药（天然药物）质量控制方法中一种可量化的、新的综合鉴别手段。特征图谱釆用相似度评价的方式，对指纹图谱中的指纹峰进行区分，也就是将得到的共有峰再次区分为一般指纹峰和特征指纹峰，其中特征指纹峰基本可以代表指纹图谱的整体特征，用于鉴别中药（天然药物）真伪，评价制剂均一性和稳定性。
  （一）建立原则
  指纹图谱的建立，其目的是全面反映中药（天然药物）所含内在化学成分的种类和数量，进而反映中药（天然药物）质量。因此，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，并体现系统性、特征性、稳定性三个原则。
  系统性指的是指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药（天然药物）有效部分所含大部分成分的种类，或指标成分全部。如人参的有效成分多为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能多地反映其中的皂苷成分。
  特征性指的是指纹图谱中反映的化学成分信息（具体表现为保留时间、位移值等）是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药（天然药物）的真伪与优劣，成为中药（天然药物）自身的“化学条形码”。
  稳定性指的是所建立的指纹图谱在规定的方法和条件下，不同的操作者和不同的实验室应能做出相同的指纹图谱，其误差应在允许范围内，这样才能保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性，也是作为标准方法必备的特征之一。
  （二）建立方法与步骤
  中药（天然药物）指纹图谱的建立方法应当遵循系统性、特征性和稳定性三个原则。建立指纹图谱的主要过程包括样品的收集、制备方法、分析方法以及结果处理。
  1.样品的收集
  由于中药（天然药物）来源广泛，所含化学成分的种类和数量不仅因品种而异，也常与其生长环境（气温、土质、施肥、降雨量等）、采收时间、炮制工艺、储存等有关。因此，为了确保指纹图谱的系统性，样品的收集必须具有广泛代表性，尤其对于不同产地、不同采收期及加工方式的样品的收集。通过对具有不同代表性的大量样品的分析，可以从中提取出同种药材稳定的共有信息。
  2.样品的制备方法
  通过采用适宜的制备方法，将样品中的化学成分提取、富集是保证指纹分析的前提。在建立制备方法时，一般要考察提取溶剂、粗分或者精制过程，通过比较，选择可以避免成分干扰，同时又能全面反映成分信息的制备方法。
  3.分析方法
  在指纹图谱研究中，液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法等色谱方法是常用的分析手段。目前应用最多的是液相色谱法，如HPLC、UPLC等。
  指纹图谱的色谱条件选择是整个研究检测方法中最重要的内容，以HPLC为例，色谱柱、流动相、检测器、进样量、柱温等均是影响指纹图谱建立的重要因素。此外，指纹图谱的测定方法应进行仪器精密度、方法重现性、样品稳定性等方法学验证，以保证方法结果的可靠性、可重复性和耐用性。
  4.结果处理
  1）指纹特征的选择
  为了保证结果的准确性，液相色谱的指纹图谱中一般要加入内标物或指认某一对照品，釆用相对保留时间和相对积分面积作为评价指纹图谱中色谱峰的参数，通过对大量样品的指纹图谱分析，提取岀共有峰，并确定这些共有峰与内标物或对照品的相对保留时间和相对积分面积，利用数据处理，得出参数的变动范围。
  2）数据处理及评价
  指纹图谱给出的有关质量信息量远比任何单一成分或多指标测定所得的信息量要多，因此需要通过化学计量学手段评价指纹图谱的复杂体系，常用的方法有相似度评价方法、化学模式识别法等。
  相似度评价方法是目前指纹图谱评价中的主流方法，利用相似度来判定指纹图谱的相似情况，被认为符合指纹图谱的整体性和模糊性特征。可供选择的相似度算法很多，包括相关系数法、夹角余弦法、距离算法（马氏距离、欧氏距离）等。国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件具有对指纹图谱的相关参数进行自动匹配，标定药材共有色谱峰，给出对照指纹图谱，计算相似度等功能。
  化学模式识别法是根据物质所含的化学成分用计算机对其进行分类或描述。由于指纹图谱数据复杂，人工釆样难免影响结果的准确性，若将其与数理统计学、计算机图谱解析和识别技术结合起来，根据化学计量学的理论依据，一些新的定量评价化学特征指纹图谱的方法开始得到应用，方法主要有：主成分分析法、聚类分析、人工神经网络等。
  五、定量分析与方法学验证
  定量分析是评价畲药质量的重要手段，对于保证畲药有效性和安全性意义重大。目前常用的方法有分光光度法和色谱法，主要有紫外-可见分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等。分光光度法主要用于定量分析畲药中的大类成分，如总黄酮的含量测定。色谱法用于定量分析畲药中的有效成分或者指标成分，如柳叶蜡梅中山奈酚-3-0-芸香糖苷等成分的含量测定。
  对于畲药中多类成分的同时分析，一般选择紫外、二极管阵列检测器分析有紫外吸收的成分。若成分没有紫外吸收，则可以选择通用型检测器，如蒸发光散射检测器、质谱检测器等。其中，质谱检测器更为专属和灵敏，与液相或气相色谱设备联用后可实现不同结构类型成分的同时检测。
  传统的多指标含量测定要求种类繁多的对照品，当化学成分对照品难以获取、价格昂贵或稳定性差时，可以采用替代对照品测定法实现多成分的同时定量分析，以一测多评法最为常用，即使用一个对照品同时定量分析多个待测成分。其基本原理：依据在一定的范围（线性范围）内成分的量（浓度或质量）与检测器响应成正比的原理，符合朗伯-比尔定律。在多指标质量评价时，假设某样品中含有，•个组分，（1=1，2，…，k，…，贝），式中4•为组分峰面积，Ｗｉ为组分浓度。选取其中的一个组分&为参照物，建立组分*与其他组分四之间的相对校正因子心队WdWmXWW，由此可导出计算公式：脂阳曲（fmQ，其中4为内参物的峰面积，阿为内参物的浓度，九，为其他组分峰面积，厶为其他组分协的浓度。相对校正因子理论上为恒定值。为保证测定结果的准确性，待测成分与参照物以同类成分为宜，紫外检测器可行性最佳。待测成分的定位和相对校正因子的测定与耐用性考察是一测多评的关键因素。
  用于定量分析的方法必须进行验证，以证明釆用的含量测定方法符合相应分析要求。验证内容包括：专属性、准确度、精密度、线性、范围、检测限、定量限、耐用性。
  (―)准确度
  准确度(accuracy)是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，…般用回收率(recoveryrate，％)表示。准确度应在规定的范围内测试。
  1.测定方法的准确度
  可用已知纯度的对照品做加样回收率测定，于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品依法测定，用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。加入对照品的量要适当，过小相对误差较大，过大真实性差；对照品的加入量与供试品中已知含有量之和必须在标准曲线的线性范围之内。
  2.数据要求
  在规定范围内，取同一浓度的供试品溶液，用6个测定结果进行评价；或设计3个不同浓度，各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价，一般中间浓度为所取供试品含量的100％水平，其他两个浓度分别为供试品含量的80％和120％«应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率计算值，以及回收率的相对标准偏差(RSD)或可信限。
  (二)精密度
  精密度(precision)是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度验证内容包括重复性、中间精密度和重现性。
  1，重复性(repeatability)
  重复性是指在相同操作条件下，由同一个分析人员连续测定所得结果的精密度，亦称批内精密度。可在同一条件下对同一批样品制备至少6份以上供试品溶液(〃N6)，或设计3个不同浓度各分别制备3份供试品溶液(”=9)，进行测定，计算含量的平均值和相对标准偏差(RSD)，RSD值一般要求不大于5％。
  2，中间精密度(intermediateprecision)
  中间精密度是指在同一个实验室，在不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度。为考察随机变动因素对精密度的影响，应进行中间精密度试验，变动因素包括不同日期、不同分析人员、不同设备。
  3，重现性(reproducibility)
  重现性是指在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度。法定标准釆用的分析方法应进行重现性试验。如建立药典分析方法时，可通过协同检验得出重现性结果，协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验用样品本身的质量均匀性和储存运输过程中的环境影响因素，以免影响重现性结果。
  （三）专属性
  专属性（specificity）是指在其他成分可能存在的情况下，釆用的方法能正确测定出被测成分的特性，亦称为选择性（selectivity）。通常以不含被测成分的供试品作为空白样品，进行实验来说明方法的专属性。色谱法中被测成分的分离度应符合要求（N1.5）空白样品的色谱图中应在相应保留时间处无干扰峰。若无法制备空白样品，可采用二极管阵列检测器和质谱检测器进行峰纯度检査。
  （四）检测限
  检测限（limitofdetection，LOD）是指供试品中被测成分能被检测出的最低浓度或最小量，无须准确定量。通常以信噪比法测定，即用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）为3：1或2：1时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。
  （五）定量限
  定量限（limitofquantification，LOQ）是指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。该指标反映分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。常用信噪比法测定定量限，一般以信噪比（SIN）为10：1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。
  （六）线性
  线性（linearity）是指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测成分浓度直接成正比关系的程度。线性是定量测定的基础。
  应在规定的范围内测定线性关系。可将储备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，需至少制备5个浓度的对照品。以测得的响应信号作为被测成分的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时（如采用蒸发光散射检测器时），响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。线性关系的数据包括回归方程、相关系数和线性图，回归方程的相关系数G）越接近于1，表明线性关系越好。
  （七）范围
  范围（range）是指能达到一定准确度、精密度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。对于有毒性的、具特殊功效或药理作用的化学成分，其范围应大于被限定含量的区间。
  （八）耐用性
  耐用性（robustness）是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。耐用性表明测定结果的偏差在可接受的范围内，以及测定条件的最大变动范围。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中注明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、提取时间等；液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成或pH、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等；气相色谱法中的变动因素有：不同厂牌或不同批号的色谱柱、固定相、不同类型的担体、柱温、进样口和检测器温度等。
  经试验，应说明测定条件发生小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。
  六、DNA条形码分子鉴定
  DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别的辅助手段和有效补充。
  （―）中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则的建立
  为解决中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，陈士林团队基于大量实验样本在国际上首先验证并确立ITS2序列作为药用植物通用条形码，并在大量中药材基原物种及其混伪品的鉴定工作中得到良好应用。随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及，国家药典委员会于2012年讨论通过在《中国药典》（2010年版）增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，该指导原则已收录至《中国药典》（2015年版）通则中，使中药材DNA条形码鉴定进一步规范化。该指导原则主要内容为以ITS2为主体条形码序列的中药材鉴定方法体系，其中植物类中药材选用ITS2/ITS为主体序列，以叶绿体psbA-tmH为辅助序列，动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列。
  （二）DNA条形码技术在中药材鉴定中的应用
  中药材品种繁多，习用品、代用品及多基原、同名异物、同物异名等现象一直是影响中药安全性、有效性的重要问题。传统的基原、性状、显微和理化鉴定等方法对鉴定者的专业水平和经验依赖性较强，易受主观因素的影响，同时也存在局限性，难以满足实际工作需求。
  以ITS2为主、psbA-trnH为辅的植物类药材的DNA条形码鉴定体系和以COI为主的动物类药材的DNA条形码鉴定体系已收录为《中国药典M2015年版）四部通则之一，DNA条形码技术在中药材领域的应用必将促使我国中药材市场更加标准化、规范化，与时俱进。基于大量中药材样本DNA条形码鉴定研究，ITS2已成为植物类药材有效的鉴定工具，从基因层面解决了中药材与混伪品的物种识别问题，创建中药材DNA条形码分子鉴定体系，为中草药建立了“基因身份证”。2012年和2015年，陈士林团队先后出版的专著《中药DNA条形码分子鉴定》和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》，奠定了我国中药材DNA条形码分子鉴定体系的理论和应用基础，标志着中药鉴定学迈入通用化、标准化基因鉴定时代。
  (三)DNA条形码分子鉴定技术流程
  1.样品釆集与保存
  对于中药材原植物，釆集用作DNA条形码研究的实验材料应为健康、新鲜，没被真菌、细菌和病毒等感染的叶片、花、芽、果实或种子等组织或器官，要遵循一定的采样规范，注意样本个数、压制凭证标本、拍摄原植物照片及生境照片，并详细观察记录原植物形态特征，同时用GPS仪定位，记录海拔等。
  一般来说，新鲜材料采集后最好及时提取DNA，如在野外，不便提取，则应尽可能快地放在避光的冷环境中，如液氮罐、干冰箱、冰壶、冰袋中，并尽快运回实验室处理备用。对于那些分布在远离实验室交通极为不便的边远地区，要釆集和及时运输新鲜材料提取DNA十分困难，目前普遍釆取的取样和保存植物样品的方法是硅胶干燥法。
  对于釆集回来的新鲜样品如要长期保存，应经液氮处理后储存在-80笆冰箱或直接储放于液氮中，且在与提取缓冲液接触前，应防止冰冻的样品在空气中融化，否则酚类易被氧化。对于已干燥好的植物材料，仍可置于塑料袋中，并留有少许硅胶，放在室温下的干燥器中几个月或长期储存在-80P冰箱中待用，但注意要密封好，以防吸潮。
  2.DNA提取
  中药材DNA的提取包括破碎细胞、释放核酸，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、沉淀与洗涤等步骤。
  1)试剂盒法(适用于动物、植物和真菌类药材)
  使用试剂盒与其他方法相比较更省时省力，方法相对简洁、易控，对于普通样品大多数实验室可采用商业化的试剂盒提取DNA，具体操作步骤参照相关试剂盒的说明书，使用时可根据需要进行调整，在大多数动物药材、植物药材中都获得了较为理想的结果。
  2)CTAB法(适用于植物和真菌类药材)
  (1)原药材用无水乙醇擦洗表面后，用刀片取其内部组织0.02〜0.1g，在液氮中迅速研磨使呈糊状或粉状，在研磨时及时加入少许抗坏血酸钠和聚乙烯毗咯烷酮(PVP)干粉(加入量视样品材料而定)，或用研磨仪进行研磨。
  (2)将糊状或粉状物转入1.5〜2mL离心管后，加入600〜1000卩L65°C预热的2％十六烷基三甲基漠化铵(CTAB)提取液(2％CTAB，100mmol/LpH8.0Tris-HCl，1.4mol/LNaCI，20mmol/LEDTA)，0.1％〜2％好蔬基乙醇，放入水浴锅中65℃保温30-60min(对于保存时间较久的样品，可适当增加水浴时间)，其间温和混匀数次。
  (3)12000r/min离心10min。将上层溶液转入另一个1.5mL离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，缓慢翻转离心管使内含物充分混匀后形成乳浊液，在12000r/min离心10min，小心取出上清液转入新离心管。
  (4)重复上述步骤一次。
  (5)取上清液，加入2/3体积的-20°C预冷的异丙醇，在-20°C下放置30min或过夜。
  (6)在12000r/min离心10〜20min收集沉淀，70％〜75％乙醇清洗，室温下或超净工作台中自然风干DNAo
  (7)将此沉淀加入合适体积的无菌双蒸水或TE(Tris-EDTA)缓冲液，4笆保存备用或放入-20°C保存。
  3.PCR扩增
  聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是快速扩增DNA序列最常用的方法。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下这种循环的不断重复。各DNA条形码序列所用PCR通用引物如下：
  ITS2片段
  正向引物 ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAA「3，；
  反向引物 ITS3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAA1^31»
  psbA-trnH片段
  正向引物：5，-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3，；
  反向引物：5，-CGCGCATGGTG-GATTCACAATCC-3，。
  COI序列
  正向引物 LCO1490：5JGGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
  反向引物 HCO2198：5，-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，o
  PCR反应体系以25/L为参照，反应体系为：PCR缓冲液(10X)2.5gL，MgCl2(25mmol/L)2pL，三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)混合物(2.5mmol/L)2pL，上游和下游引物(2.5jimol/L)各1.0成，模板DNA，TaqDNA聚合酶1.0U，加无菌双蒸水至25jxL，也可根据具体情况加以调整。应设置未加模板DNA的阴性对照。ITS2序列扩增程序：94°C5min；94°C30s，56°C30s，72°C45s，36—40个循环；72°C10minopsbA-trnH序列扩增程序：94°C5min；94°C1min，55°C1min，72°C1.5min，30个循环；72°C7mineCOI序列扩增程序：94°C1min；94°C1min，45"C1.5min，72°C1.5min，5个循环；94°C1min，50°C1.5min，72°C1min，35个循环；72°C5min。其他DNA条形码序列PCR扩增引物应参考相关研究结果。
  模板DNA浓度也是影响PCR扩增效果的一个重要因素。在最初扩增时需根据具体样品，设计模板浓度梯度，考察模板适宜浓度，以获得理想的扩增条带。
  釆取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，阴性对照应无条带，目的产物如条带单一，可直接测序；如有多条带或出现拖尾现象，则需在紫外光下快速有效地切下所需片段所在位置的凝胶，然后再选用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，回收后的产物还要进一步经琼脂糖凝胶电泳检测后，测序。
  测序原理同Sanger测序法，PCR扩增引物作为测序引物，使用DNA序列测序仪进行双向测序，目前各地均有专业的测序服务公司进行DNA测序服务。
  4.序列拼接流程
  1)序列质量与方向
  为确保DNA条形码序列的可靠性，序列拼接时，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量部分。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
  2)序列拼接
  应用专业的序列拼接软件进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接。获得高质量序列后，对于ITS2序列，根据HiddenMarkovModel(HMM)模型，去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列：对于psbA-trnH，根据GenBank数据库中同科属物种psbA-trnH的注释，去除序列两端的ps財和基因，获得完整的如H基因间隔区；CO1序列可直接进行后续分析。
  5.物种鉴定流程
  将获得的序列应用BLAST(basiclocalalignmentsearchtool)方法进行结果判定，BLAST法是通过两两序列局部比对来査询数据库中与之最匹配的序列。BLAST结果中相似性最高的序列对应的物种为查询序列对应的物种。可以在中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)或GenBank数据库中进行BLAST鉴定。
  (四)畲药DNA条形码分子鉴定研究实例
  食凉茶为蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属植物柳叶蜡梅(ChimonamhussalicifoliusS.Y.Hu)或浙江蜡梅(ChimonanthuszhejiangensisM.C.Liu)的干燥叶，又名食凉餐、食凉青、石凉撑、山蜡茶、黄金茶、香风茶等，是畲族应用最广的药材之一，有“畲药第一味”之称，以畲族习用药材名义收载于2015年版《浙江省中药炮制规范》。
  由于食凉茶基原植物的化学成分及药理作用与同科蜡梅属其他物种如蜡梅\Chimonanthus praecox(L.) Link］、山蜡梅(Chimonanthus nitensOliv.)、西南蜡梅(Chimonanthus campanulatus R.H. Chang et C.S.Ding)和夏蜡梅属美国蜡梅(Calycanthus floridus L.)、夏蜡梅［Calycanthus chinensis (W.C.ChengetS.Y.Chang)W.C. Cheng etS. Y.Chang ex P.T. Li］存在明显差异，混用乱用严重影响食凉茶的临床疗效与用药安全，因此对其进行准确鉴定显得尤为重要。我们对食凉茶基原植物及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究。首先，釆集了多个区域的蜡梅属和夏蜡梅属的多种植物及部分商业茶产品，具体样品采集情况见表3-1。
  经分析后发现，柳叶蜡梅23条ITS2序列的GC含量平均为71.23％，有3个单倍型单倍型A1有16条，占69.56％，A2有5条，占21.74％，A3有2条，占8.70％，种卩K2P遗传距离为0〜0.008；浙江蜡梅ITS2序列有15条，GC含量平均为71.07％，有:个单倍型，单倍型B1有14条，占93.33％，B2有1条，占6.67％，种内K2P遗传距富为0〜0.004，柳叶蜡梅与浙江蜡梅间K2P距离为0.004〜0.008（表3-2和表3-3）。其ft）近缘混伪品ITS2序列长度为256〜260bp，GC含量为70.98％〜72.73％。食凉茶基原効种及其混伪品ITS2序列长度、GC含量及品种间序列比对等具体情况见表3-2和图3-1畲药食凉茶基原物种与混伪品的种间遗传距离为0.004〜0.078，食凉茶基原物种柳叶蜉梅和浙江蜡梅与夏蜡梅种间K2P距离均最大（表3-3）。通过基于ITS2序列（单倍型）构建的食凉茶基原植物及其混伪品的NJ系统聚类树（图3-2）可以看出，食凉茶基原程物柳叶蜡梅和浙江蜡梅的序列聚为一支，其近缘物种蜡梅、山蜡梅、西南蜡梅、美国弟梅及夏蜡梅各自聚为一支，能够与食凉茶基原植物明显区分开。市场上流通的两个食讲茶商业茶样品Chl7、Chi8经鉴定其基原植物为柳叶蜡梅。上述蜡梅科7种植物的ITS：主导单倍型序列特征如图3-3所示。因此，ITS2序列可作为食凉茶的DNA条形码，帛够准确、有效地鉴别食凉茶基原植物及其混伪品。